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目的：
内质网膜蛋白复合物3（EMC3），又称跨膜蛋白111（Transmembrane Protein111，TMEM111）、视动反应b（pob），是2009年发现的内质网膜蛋白复合物的一员。EMC3在进化上高度保守、生物界表达广泛，并且在生物内表达量丰富，其功能主要表现在维持细胞内蛋白质稳态上。EMC3在斑马鱼中影响感红视锥细胞的存活，在果蝇中影响视紫红质的生物合成。关于EMC3在哺乳动物视觉系统中的功能，仅有一项相关报道：小鼠光感受器细胞缺失EMC3会引起退行性病变。视紫红质缺失是视网膜色素变性等疾病的重要原因。而关于EMC3在哺乳动物视网膜发育中的功能表现却未有报道。本研究旨在利用小鼠模型探究EMC3在哺乳动物视网膜发育中的作用。
方法：
（1）明确EMC3在小鼠视网膜发育过程中的时空表达：以野生型C57BL/6J小鼠为研究对象，分别于E11.5、E15.5、P0.5及P7取视网膜组织，制备石蜡切片，运用RNAscope原位杂交技术检测EMC3的表达。
（2）特异性敲除EMC3对小鼠视网膜发育的影响：利用Cre/loxP系统及同源重组原理，将Emc3flox/flox小鼠与视网膜特异性表达Cre的小鼠（Six3-cre）小鼠杂交获得EMC3视网膜特异性敲除小鼠（CKO），其基因型为Emc3flox/flox；Six3-cre+，以同窝Cre阴性小鼠（基因型：Emc3flox/flox；Six3-cre-）作为对照小鼠（Control）。①取E13.5、E17.5、P0.5、P7小鼠视网膜，制备石蜡切片并进行HE染色，以观察视网膜形态学改变。利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测EMC3的RNA水平；②取E13.5、E15.5、E17.5、P0.5小鼠视网膜，制备冰冻切片进行相关蛋白免疫荧光及TUNEL染色，以判断细胞分子水平变化及细胞凋亡情况。采用免疫印迹技术及蛋白组学高通量检测膜蛋白、视网膜发育及细胞应答相关基因的蛋白水平；③在小鼠5周龄进行视网膜电图（ERG）、眼底彩照及光学相干层析成像（OCT）的活体检测，以评估视网膜功能及结构。
结果：
（1）EMC3在C57BL/6J小鼠视网膜内的表达情况：EMC3的mRNA广泛分布于E11.5、E15.5、P0.5及P7视网膜全层。
（2）特异性敲除EMC3对小鼠视网膜发育的影响：①视网膜结构变性：CKO小鼠自E15.5起出现视网膜细胞排列紊乱，逐渐形成视网膜花结，花结形成处细胞由长梭形转变为圆形；②视网膜祖细胞极性被破坏：视网膜花结的形成中出现RPCs细胞极性改变以及大量的细胞凋亡。β-catenin、N-cadherin、ZO-1等细胞连接蛋白以及Par3、PKCζ、Scribble等细胞极性决定因子在视网膜花结中心内表面聚集，TUNEL凋亡信号（自E15.5天产生，并在后续发育过程中持续存在）也主要出现在视网膜花结的组成细胞中；③内质网应激的三条通路及内质网应激型凋亡均被激活：IRE1被激活、ATF6激活形式表达增加、ATF4下游转录蛋白表达水平改变、caspase12出现阳性标记。E17.5蛋白组学显示，大量膜蛋白的表达降低，其中包括V型ATP酶及ATP6AP2等定位于内膜溶酶体的膜蛋白；④细胞自噬上调：CKO小鼠在胚胎期自噬水平没有明显改变，但负责分子伴侣介导性自噬的LAMP2表达上调，同时有一些溶酶体膜蛋白的表达下调，P0.5天开始CKO小鼠自噬被激活；⑤细胞增殖及细胞分化状态改变：视网膜特异性敲除Emc3导致细胞周期内的未成熟细胞（Ki67阳性）向视网膜基底侧迁移，感光前体细胞标记物OTX2表达上调，光感受器细胞（Recoverin阳性）增多、水平前体细胞（Prox1阳性）的迁移及定位改变；⑥视功能丧失：5周龄CKO小鼠表现为熄灭型ERG。
结论：
EMC3在视网膜发育中是必不可少的，既参与了视网膜的神经发生也对视网膜结构有调控作用：1）EMC3通过调控视网膜细胞凋亡、维持视网膜祖细胞极性，调节视网膜结构。其中视网膜凋亡信号来自于细胞内蛋白稳态破坏后产生的内质网应激。2）EMC3参与调控视网膜祖细胞的增殖分化：缺失EMC3造成感光细胞分化增加，水平细胞及增殖细胞定位改变。3）EMC3参与自噬调控过程，缺失EMC3诱导细胞自噬上调。EMC3的这些功能表现对我们理解视网膜色素变性及视网膜母细胞瘤等疾病的发病机制有参考意义。
内质网膜蛋白复合物3（EMC3），又称跨膜蛋白111（Transmembrane Protein111，TMEM111）、视动反应b（pob），是2009年发现的内质网膜蛋白复合物的一员。EMC3在进化上高度保守、生物界表达广泛，并且在生物内表达量丰富，其功能主要表现在维持细胞内蛋白质稳态上。EMC3在斑马鱼中影响感红视锥细胞的存活，在果蝇中影响视紫红质的生物合成。关于EMC3在哺乳动物视觉系统中的功能，仅有一项相关报道：小鼠光感受器细胞缺失EMC3会引起退行性病变。视紫红质缺失是视网膜色素变性等疾病的重要原因。而关于EMC3在哺乳动物视网膜发育中的功能表现却未有报道。本研究旨在利用小鼠模型探究EMC3在哺乳动物视网膜发育中的作用。
方法：
（1）明确EMC3在小鼠视网膜发育过程中的时空表达：以野生型C57BL/6J小鼠为研究对象，分别于E11.5、E15.5、P0.5及P7取视网膜组织，制备石蜡切片，运用RNAscope原位杂交技术检测EMC3的表达。
（2）特异性敲除EMC3对小鼠视网膜发育的影响：利用Cre/loxP系统及同源重组原理，将Emc3flox/flox小鼠与视网膜特异性表达Cre的小鼠（Six3-cre）小鼠杂交获得EMC3视网膜特异性敲除小鼠（CKO），其基因型为Emc3flox/flox；Six3-cre+，以同窝Cre阴性小鼠（基因型：Emc3flox/flox；Six3-cre-）作为对照小鼠（Control）。①取E13.5、E17.5、P0.5、P7小鼠视网膜，制备石蜡切片并进行HE染色，以观察视网膜形态学改变。利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测EMC3的RNA水平；②取E13.5、E15.5、E17.5、P0.5小鼠视网膜，制备冰冻切片进行相关蛋白免疫荧光及TUNEL染色，以判断细胞分子水平变化及细胞凋亡情况。采用免疫印迹技术及蛋白组学高通量检测膜蛋白、视网膜发育及细胞应答相关基因的蛋白水平；③在小鼠5周龄进行视网膜电图（ERG）、眼底彩照及光学相干层析成像（OCT）的活体检测，以评估视网膜功能及结构。
结果：
（1）EMC3在C57BL/6J小鼠视网膜内的表达情况：EMC3的mRNA广泛分布于E11.5、E15.5、P0.5及P7视网膜全层。
（2）特异性敲除EMC3对小鼠视网膜发育的影响：①视网膜结构变性：CKO小鼠自E15.5起出现视网膜细胞排列紊乱，逐渐形成视网膜花结，花结形成处细胞由长梭形转变为圆形；②视网膜祖细胞极性被破坏：视网膜花结的形成中出现RPCs细胞极性改变以及大量的细胞凋亡。β-catenin、N-cadherin、ZO-1等细胞连接蛋白以及Par3、PKCζ、Scribble等细胞极性决定因子在视网膜花结中心内表面聚集，TUNEL凋亡信号（自E15.5天产生，并在后续发育过程中持续存在）也主要出现在视网膜花结的组成细胞中；③内质网应激的三条通路及内质网应激型凋亡均被激活：IRE1被激活、ATF6激活形式表达增加、ATF4下游转录蛋白表达水平改变、caspase12出现阳性标记。E17.5蛋白组学显示，大量膜蛋白的表达降低，其中包括V型ATP酶及ATP6AP2等定位于内膜溶酶体的膜蛋白；④细胞自噬上调：CKO小鼠在胚胎期自噬水平没有明显改变，但负责分子伴侣介导性自噬的LAMP2表达上调，同时有一些溶酶体膜蛋白的表达下调，P0.5天开始CKO小鼠自噬被激活；⑤细胞增殖及细胞分化状态改变：视网膜特异性敲除Emc3导致细胞周期内的未成熟细胞（Ki67阳性）向视网膜基底侧迁移，感光前体细胞标记物OTX2表达上调，光感受器细胞（Recoverin阳性）增多、水平前体细胞（Prox1阳性）的迁移及定位改变；⑥视功能丧失：5周龄CKO小鼠表现为熄灭型ERG。
结论：
EMC3在视网膜发育中是必不可少的，既参与了视网膜的神经发生也对视网膜结构有调控作用：1）EMC3通过调控视网膜细胞凋亡、维持视网膜祖细胞极性，调节视网膜结构。其中视网膜凋亡信号来自于细胞内蛋白稳态破坏后产生的内质网应激。2）EMC3参与调控视网膜祖细胞的增殖分化：缺失EMC3造成感光细胞分化增加，水平细胞及增殖细胞定位改变。3）EMC3参与自噬调控过程，缺失EMC3诱导细胞自噬上调。EMC3的这些功能表现对我们理解视网膜色素变性及视网膜母细胞瘤等疾病的发病机制有参考意义。