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临床麻醉中常用的静脉麻醉药异丙酚因为其酚结构而具有抗氧化应激作用,大量的体外和体内研究已经证实了异丙酚的细胞和器官保护作用。先前的研究认为异丙酚抗氧化应激作用的机制包括清除H2O2,减少脂酯过氧化物的形成,减少一氧化氮合酶的形成及稳定线粒体膜。最近的研究提出异丙酚可能是通过上调血红素合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)来发挥细胞保护作用的。HO-1也称为热休克蛋白32,HO-1对细胞的保护作用源于其代谢产物的抗炎及抗氧化应激作用。然而,研究认为在正常状态下,仅大剂量的异丙酚能够诱导HO-1表达上调,而临床相关剂量的异丙酚能否影响HO-1表达变化尚不清楚。有丝分裂激酶蛋白家族(Mitogen-actived protein kinases, MAPKs),核转录因子κB (Nuclear factor-KB, NF-κB)及活化状态的核因子相关因子2(Nuclear factor-E2related factor2,Nrf2)参与HO-1表达上调的信号转导。若临床相关剂量的异丙酚能够诱导HO-1表达上调,那么这些信号分子很可能参与这一过程的信号传导。因此,在正常及氧化应激状态下,临床相关剂量的异丙酚能否上调HO-1的表达以及MAPKs, NF-κB和Nrf2是否参与异丙酚介导的HO-1表达上调尚不清楚,此外,若临床相关剂量的异丙酚在正常或氧化应激状态下能够诱导HO-1表达上调,那么这种表达上调是否参与或部分参与异丙酚的细胞保护作用(抗凋亡等)有待于细胞学实验来阐明。在这个背景下,本研究第一部分拟探讨临床相关剂量的异丙酚对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs) HO-1mRNA和蛋白表达的作用及其细胞保护作用是否与HO-1有关,同时观察MAPKs、NF-κB和Nrf2在这一过程中是否具有信号传递作用。本研究第一部分中异丙酚的溶剂二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)可与许多有机溶剂及水相溶。在临床,DMSO具有一定的治疗作用,已成功用于治疗肺腺癌,胃肠疾病,慢性前列腺炎,皮肤疾病,还可以作为一种区域镇痛药物。然而,DMSO治疗作用的潜在分子机制尚不清楚。在进行本研究第一部分实验时,意外发现大剂量的DMSO能够诱导HO-1mRNA表达上调。鉴于DMSO在临床的应用,我们推测DMSO的药物治疗等保护作用可能与诱导HO-1表达上调有关,因此首先通过系统的实验来明确DMSO能否诱导HO-1表达上调及活性增加尤为重要。由于DMSO同样对MAPKs具有激活或抑制作用,因此,与本研究第一部分的研究设计相同,第二部分实验拟探讨DMSO作用于HUVECs对HO-1mRNA和蛋白表达及酶活性的影响,同时研究MAPKs, NF-κB和Nrf2在其中的信号转导作用。实验第一部分的结果表明在正常状态下,临床相关剂量的异丙酚在HUVECs不能诱导HO-1mRNA表达上调,而在H202诱导的氧化应激状态下,异丙酚以剂量和时间依赖的方式增加了HO-1mRNA和蛋白表达水平及酶活性。在氧化应激状态下ERKs特异性阻断剂PD98059显著降低了异丙酚所引起的HO-1蛋白表达上调,而p38-MAPKs和JNKs阻断剂SB203580和SP600125对异丙酚所引起的HO-1蛋白上调无显著作用。这些数据表明,ERKs信号通路参与了异丙酚所引起的HO-1上调的信号传导。进一步研究证实在氧化应激状态下,异丙酚以剂量相关的方式增加ERKs磷酸化水平,这种作用被PD98059所阻断。此外,异丙酚能够显著降低H202在内皮细胞引起的细胞凋亡率。进一步而言,异丙酚的这种保护作用可部分被HO-1特异性阻断剂ZnPPIX所阻断,因此表明HO-1是异丙酚在脐静脉内皮细胞保护作用的一个重要分子机制。H202可增加NF-κB p65磷酸化水平及核转移,而异丙酚单独应用时对NF-κB p65磷酸化水平及核转移无显著影响,但当异丙酚与H202联合应用时NF-κBp65磷酸化水平及核转移水平较单独应用H202时显著上调,说明异丙酚在氧化应激状态下能够增加NF-KBp65磷酸化水平及核转移,进一步的研究表明这一过程可被ERKs阻断剂PD98059阻断,提示NF-κB可能是ERKs信号通路最终导致HO-1表达上调的下游信号分子。实验第二部分的结果表明DMSO能够在HUVECs诱导HO-1mRNA和蛋白表达上调及活性增加,当DMSO浓度为0.1%时显著增加HO-1蛋白表达水平。0.8%的DMSO作用于HUVECs达到1h后,HO-1的蛋白表达水平呈显著上调。0.2%的DMSO作用于HUVECs10h对HO-1酶活性的上调水平具有统计学意义。用0.8%的DMSO作用于HUVECs时间达到8h时,HO-1酶活性显著增加。JNKs抑制剂SP600125显著阻断了DMSO诱导的HO-1蛋白表达上调。然而,ERKs和JNKs抑制剂PD98059和SB203580却对此过程无明显作用。在此基础上,本研究进一步发现0.8%的DMSO以时间依赖的方式增加JNKs磷酸化水平,而对ERKs和p38-MAPKs的磷酸化水平却无显著影响。这些数据充分表明JNKs激活参与了DMSO所介导HO-1表达上调的信号传导。DMSO以时间依赖的方式增加Nrf2的核内蓄积。在EMSA实验中,在无DMSO处理的内皮细胞,未发现与Nrf2结合复合物,而在DMSO处理的细胞中,Nrf2的核转移和DNA结合显著增加。抗氧化反应元件结合物在DMSO处理10min钟后开始增加并持续至60min。为进一步证实Nrf2在DMSO上调HO-1的作用,本研究采用Nrf2siRNA干扰Nrf2的表达,结果显示Nrf2-siRNA可将DMSO诱导的HO-1表达减少38%。由此,充分说明了Nrf2在DMSO上调HO-1中的作用。本研究首次报道了异丙酚和DMSO在HUVECs能够诱导HO-1mRNA和蛋白表达上调并且初步明确这两个过程中的潜在分子机制。鉴于内皮细胞系统在维持内环境稳态方面起着重要的屏障作用,因此本研究的结果能够为麻醉药异丙酚在一些特殊临床情况下应用提供新的理论基础,如发生脑缺血再灌注损伤时。本研究第二部分发现DMSO为HO-1的一种新型药理学诱导剂,这为今后在细胞水平进行与诱导HO-1表达相关的研究提供了新的方法学参考,并为DMSO的临床靶向治疗提供了药理学基础和深入研究的理论参考;但同时也强调了在与HO-1表达相关的研究中,当DMSO作为目标研究药物溶剂时,应设立相关对照来调整浓度以排除非特异性干扰。