目的：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，也称骨髓基质细胞，是继胚胎干细胞和神经干细胞之后，又一种在体内外均能向神经细胞分化的干细胞。具有向成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等多向分化的能力，由于其具有取材方便，体外培养容易、易于诱导、易分离扩增、自身移植不产生免疫排斥等特点，MSCs成为神经系统疾病细胞治疗或基因治疗的种子细胞，是神经细胞移植理想的供体。为了寻找更为理想的诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的药物及最佳诱导条件，本课题用脑苷肌肽注射液作为诱导剂，诱导MSCs向神经细胞转化，以期为MSCs用于神经细胞移植提供理论与实验依据。 方法 1.取雄性6周SD大鼠，麻醉处死后取双侧股骨和胫骨的骨髓，用贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs，传代、扩增，以获取更纯化的MSCs，再连续观察细胞形态及生长特性。 2.取生长良好的2、4、8代细胞，消化后调整细胞种植密度为(4.0×104/ml)，接种于96孔板，每孔250 ul，用唑盐比色实验(MTT)法每天固定时间测定细胞的吸光度(OD)值，连续7d。以时间(天)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制生长曲线，计算细胞倍增时间，并对三代细胞的OD值进行统计学分析。 3.用诱导剂脑苷肌肽注射液对MSCs进行诱导。在其他诱导条件不变的前提下，对比不同浓度的脑苷肌肽注射液对MSCs诱导后分化为神经细胞比例的影响。按脑苷肌肽注射液的浓度分为以下几组：1.25 ug/ml，2.5 ug/ml，5 ug/ml，10 ug/ml，20 ug/ml，)于诱导后对细胞表达巢蛋白(Nestine)，胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)，神经元烯醇化酶(NSE)的免疫组化的检测。计算阳性细胞比例，进行统计分析，选出合适的诱导剂量；对比不同诱导时间对MSCs分化为神经细胞比例的影响，按诱导时间分组：(3 d，5 d，7 d，10 d，14d，)通过免疫组化的方法进行检测，并计算阳性细胞比例，进行统计分析，找出合适的诱导时间。 4 MSCs具有多向分化潜能，为证明我们培养的细胞具有多向分化潜能，采用成骨细胞诱导液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠，10-8mmol/L地塞米松，50 mg/L维生素C，20％胎牛血清的DMEM培养液)诱导MSCs 2周，行改良Gomori钙钻碱性磷酸酶检测以鉴定成骨细胞形成。 结果： 1.分离得到的单个核细胞72 h贴壁，细胞多呈梭形，多角形，培养10-14 d可达80％融合。传代细胞24 h内完全贴壁，细胞形态较均一，呈长梭形，旋涡样生长，一般5-8 d内可达80％融合。传代细胞生长较原代要快，7 d即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的特征，随代数增加，细胞得到纯化，梭形细胞占到95％以上。 2.不同代骨髓MSCs的生长曲线第2、4、8代细胞生长曲线基本相同，呈S形。传代后第1-2 d为细胞的生长滞留期，第3-6 d为对数生长期，约第8 d进入平台期，细胞倍增时间约32 h。方差分析P＞0.05 三代细胞间无统计学差异。表明骨髓MSCs体外稳定扩增，有很强的增殖能力。 3.脑苷肌肽注射液诱导MSCs为神经元样细胞用含浓度(1.25-20 ug/ml)的诱导剂进行诱导时，随脑苷肌肽注射液浓度增高，Nestine、GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势，经免疫组化检测及统计分析，脑苷肌肽注射液浓度为(5ug/ml)时，能够诱导Nestine、GFAP和NSE阳性细胞比例为(33.57±0.63)％(61.57±2.45)％、(32.50±0.46)％，显著高于对照组P＜0.01。诱导时间3 d～14d，随时间的延长三种阳性细胞的比例也呈现逐步增高趋势，经免疫组化检测及统计分析，诱导时间为10 d时，能够诱导Nestine、GFAP和NSE阳性细胞比例为(34.54±1.01)％、(62.71±0.33)％、(32.19±0.38)％，显著高于对照组(P＜0.01)。 4 向成骨细胞诱导向成骨细胞诱导2周后，实验组碱性磷酸酶染色阳性，对照组碱性磷酸酶染色为阴性。 结论 1.实验中分离培养的单个核细胞呈贴壁生长，成纤维细胞样外观，具有典型的形态特点，并证明其可以同时向神经元样细胞和成骨细胞分化，具有多向分化潜能，表明从骨髓分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。 2.脑苷肌肽注射液是一种很好的体外诱导剂，可以诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化，以5 ug/ml脑苷肌肽注射液作诱导剂，能够获得较明显的诱导的MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的结果，诱导10 d后MSCs能有效向神经细胞和神经胶质细胞分化。