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目的研究表明自噬(Autophagy)在心肌缺血/再灌注(Myocardial Ischemia Reperfusion,MI/R)损伤中发挥一定的作用,而吗啡(Morphine,Mor)的心肌保护作用是否与自噬有关尚不明确。本研究探讨吗啡是否通过抑制自噬发挥抗缺血/再灌注损伤心肌保护作用及其具体机制。方法体外培养大鼠心脏组织来源的H9c2细胞,采用650μM H2O2构建心肌细胞氧化应激损伤模型。MTT法检测细胞增殖,激光扫描共聚焦显微镜成像法检测四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester,TMRE)标记的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,?Ψm)的变化。Real Time RT-PCR检测Atg5m RNA表达水平的变化,免疫印迹法检测LC3、Beclin1、p-m TOR蛋白水平的改变。结果1采用MTT法检测细胞增殖率,与H2O2(650μM)对照组相比,Mor(0.1μM)处理组吸光度明显增加(114.24±1.64%,P<0.05),证实了Mor具有心肌保护作用。2激光共聚焦结果显示,与H2O2对照组相比,Mor能够明显抑制m PTP的开放(TMRE荧光强度为88.00±2.74%,P<0.05),与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)作用(TMRE荧光强度为88.67±4.50%,P<0.05)相似;与Mor组相比,加入自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)后TMRE荧光值显著降低(TMRE荧光强度为59.00±3.79%,P<0.05)。提示Mor可以通过阻止m PTP的开放发挥抗氧化应激损伤作用,这种保护作用可能与Mor抑制自噬有关。3 Real Time RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,H2O2能够引起Atg5 m RNA表达的明显增高(183.70±10.87%,P<0.05),加入Mor预处理后使H2O2引起的Atg5 m RNA的表达增高被抑制(127.20±7.72%,P<0.05),Western blot结果也证实Mor能够抑制H2O2引起的LC3表达增加(125.91±5.12%,P<0.05);Western blot检测自噬正性调控蛋白Beclin1蛋白的表达,各组差异无统计学意义,而检测自噬负性调控蛋白m TOR磷酸化的表达,与空白对照组相比,H2O2能够引起p-m TOR的表达明显降低(78.24±4.20%,P<0.05),加入Mor预处理后使H2O2引起的p-m TOR的表达降低被抑制(99.69±6.01%,P<0.05)。提示Mor可能是通过激活自噬的负性调控机制发挥心脏保护作用。4 Western blot结果表明,Mor预处理组对p-m TOR表达的这种增加作用可以被自噬的激动剂Rap所阻断(H2O2+Rap+Mor组:79.34±4.02%,P<0.05),同时Mor预处理组对LC3表达的这种抑制作用也可以被自噬的激动剂Rap所阻断(H2O2+Rap+Mor组:154.18±13.38%,P<0.05),提示Mor可能通过促进p-m TOR的增加,抑制LC3蛋白的表达,减少自噬,阻止m PTP的开放,从而发挥心脏保护作用。结论Mor在氧化应激损伤时,可能通过激活自噬的负性调控机制,抑制自噬,阻止m PTP的开放,从而发挥抗缺血/再灌注损伤心肌保护作用。