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成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia,ATL)是一种恶性增殖性淋巴系肿瘤,由人类T细胞白血病1型病毒(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)感染引起。关于其发病的分子机制仍未完全阐明,因此深入探究ATL发生机制,尤其是白血病细胞恶性增殖的机理并以此寻找治疗手段成为该领域的重点。越来越多的研究表明,一类新的肿瘤调控因子长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)在肿瘤的生长、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。LncRNA是基因组中不能编码蛋白质的RNA,其转录本大于200个核苷酸。ANRIL(Antisense noncoding RNA in the INK4 Locus)是一种长链非编码 RNA,己广泛报道ANRIL与肝癌、胃癌、食管癌等肿瘤的发生密切相关,但其在ATL中的表达和功能尚不清楚。为了探究ANRIL在ATL中的作用,本研究从细胞、分子机制及体内三个水平研究ANRIL在调控ATL增殖和凋亡中的作用及其分子机制。具体内容如下:第一部分:ANRIL在ATL中异常高表达首先,本研究运用RT-PCR技术检测7种ATL细胞株MT-1、MT-2、MT-4、C8166、ATL-2、ATL-T、TL-Om1 及对照组 HTLV-1 阴性细胞株 Jurkat 中ANR见的表达情况,结果表明在ATL细胞中ANRIL呈现异常高表达,qRT-PCR也证实了ANRIL在ATL中表达异常。综上,我们从分子水平充分验证了ANRIL在ATL细胞中异常高表达。第二部分:ANRIL对ATL细胞恶性增殖的影响为了研究ANRIL对ATL细胞恶性增殖的影响并研究其分子机制,本文应用慢病毒介导的基因沉默技术敲低ANRIL基因。首先,构建shANRIL载体,利用HEK-293FT细胞包装获得对照组慢病毒及ANRIL沉默的重组慢病毒,分别感染ATL-T及ED细胞,经筛选后获得ATL-T和ED的对照组稳定株和ANRIL沉默稳定株。通过qRT-PCR确认ANRIL沉默,之后运用MTT实验、平板克隆实验检测细胞增殖情况,结果表明ANRIL沉默能抑制ATL-T及ED细胞的增殖;流式细胞术检测发现ATL细胞中ANRIL沉默能诱导ATL-T及ED细胞凋亡。此外,本研究还运用流式细胞术检测细胞周期的变化,结果显示,沉默ANRIL后ED细胞周期发生阻滞,细胞主要滞留在G1期。第三部分:ANRIL沉默抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡机制探究为了探究ANRIL沉默后引起ATL细胞凋亡的分子机制,首先运用蛋白印迹法检测ATL细胞株中ANRIL沉默后Caspase蛋白家族表达情况,结果表明ANRIL沉默可引起Caspase-3、-7、-9蛋白表达水平下调,并出现激活型的蛋白剪切带,PARP蛋白发生切割;促凋亡蛋白AIF表达量升高。细胞生长相关基因如E2F1及C-Myc的表达下调,KLF2表达上调。ATL细胞中NF-κB通路持续激活。为了研究ANRIL是否参与调控NF-κB信号通路,本文运用双荧光素酶报告基因实验检测ANRIL对NF-κB信号通路的影响。实验结果显示,ANRIL单独不能激活NF-κB信号通路,但ANRIL能够促进Tax介导的NF-κB信号通路。p65是经典NF-κB途径中的重要成员蛋白。同样运用双荧光素酶报告基因实验,检测结果发现ANRIL和EZH2均可增强p65介导的NF-κB信号通路,同时表达ANRIL、EZH2和p65后呈现更显著的NF-κB信号通路激活。因此,ANRIL、EZH2和Tax(或p65)三者协同激活NF-κB信号通路。综上,ANRIL主要通过调控凋亡相关蛋白的表达以及肿瘤发生的信号通路从而影响肿瘤细胞生长和凋亡。第四部分:小鼠成瘤实验为了从体内层面进一步证实ANRIL的作用,本文运用了小鼠成瘤模型进行探究。选用ANRIL沉默效果较好的shANRIL#1 ED细胞及对照组ED细胞分别皮下注射小鼠,三周后将小鼠处死,取皮下瘤组织标本观察并实验。结果显示,注射shANRIL#1 ED细胞的小鼠瘤体的大小和质量均小于对照组,表明ANRIL沉默后瘤体形成能力明显降低。将肿瘤组织取出一部分用于提取RNA后逆转录成为cDNA,并检测与肿瘤发生相关基因的表达情况,结果表明注射shANRIL#1 ED细胞小鼠组织中E2F1、KLF2及C-Myc的表达均下调。综上所述,本研究证实了ANRIL在ATL中异常高表达,并验证了ANRIL具有促进ATL细胞的增殖和细胞周期进程、抑制细胞凋亡的作用。小鼠体内实验进一步证明了 ANRIL具有促进肿瘤发生的作用。本课题为丰富成人T细胞白血病发生机制提供依据,为ATL的治疗提供新的靶点,也为未来成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。