第1章引言肥胖是近年来困扰人类健康最主要的危险因素之一,会诱发一系列病症,其中血管内皮损伤是肥胖进程中最早出现的病变之一,也是最主要的致死因素。一般认为血管内皮损伤与异常脂代谢密切相关,近几年的研究显示,在肥胖状态下,能量代谢稳态失衡可归咎于线粒体活动异常。为了维持能量代谢的稳态,线粒体的形态、数量、分布和功能都会发生不断的变化。同时机体能量稳态失衡,会导致脂肪细胞、血管细胞、神经元和免疫细胞以及它们所分泌的细胞因子组成的脂肪微环境发生改变。Asprosin（ASP）是一种新发现的脂肪因子,在调控糖脂代谢稳态等方面发挥了重要作用。ASP可以通过结合肝脏上嗅觉受体734（OLFR734）促进肝脏葡萄糖的释放,还可以直接透过血脑屏障作用于下丘脑促进食欲。在肥胖人群中,其水平的异常增高参与了心血管疾病（CVD）的进展和糖尿病等疾病的病理生理过程。但ASP在肥胖状态下对血管内皮功能障碍中的作用以及机制尚不清楚。本研究围绕“肥胖状态下异常升高ASP与血管内皮功能障碍之间的关系”进行了较为深入的系统研究。我们首先采用不同水平ASP处理人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）和大鼠主动脉血管内皮细胞（RTAECs）,观察ASP对血管内皮细胞功能及线粒体动力学稳态的影响;其次建立脂肪组织特异性ASP缺陷（ASP-deficiency）小鼠模型和高脂饮食（HFD）诱导小鼠肥胖模型,从整体水平研究ASP在血管内皮功能障碍发生发展中的作用及机制;最后应用小干扰sh RNA技术敲减DRP1以及DRP1药理特异性抑制剂（MDIVI-1）抑制线粒体fission,从细胞和分子水平探究ASP对血管内皮细胞胰岛素信号通路（PI3K/AKT/eNOS）的改变及其导致血管内皮功能障碍的分子机制。故本研究从整体动物、组织器官、细胞和分子水平多层面探究不同的ASP水平对血管内皮功能、胰岛素信号通路和线粒体动力学稳态的影响,为肥胖及肥胖相关CVD的防治提供新的策略,也为以ASP为靶标开展的新药研发奠定坚实的实验基础。第2章脂肪因子ASP对血管内皮细胞功能影响目的:在体外细胞水平采用人工重组的ASP处理HUVECs和RTAECs,以此模拟肥胖条件下ASP升高,观察ASP对血管内皮细胞功能的影响;并通过Western blot实验探索PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表达及激活情况,初步探讨ASP和血管内皮细胞功能之间的关系,为后续研究ASP在血管内皮功能障碍发生发展中的作用奠定基础。方法:1.摸索ASP处理浓度。设置一系列ASP浓度梯度（20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L和100 nmol/L）分别加入到HUVECs和RTAECs细胞培养基中作用48 h。采用MTT检测ASP对血管内皮细胞的活力影响。2.设置一系列ASP浓度梯度（1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L）分别加入到HUVECs和RTAECs细胞培养基中作用48 h,最后用胰岛素（100 nmol/L）作用细胞30 min。检测（1）一氧化氮（NO）水平:NO检测试剂盒（硝酸还原酶法）检测HUVECs和RTAECs细胞培养液中NO水平。（2）丙二醛（MDA）含量:使用MDA试剂盒检测;（3）胰岛素信号通路检测:Western blot法检测血管内皮细胞中PI3K/AKT/eNOS通路蛋白及磷酸化蛋白水平。结果:1.随着ASP浓度增加（20 nmol/L、40 nmol/L、60 nmol/L、80 nmol/L、100 nmol/L）,ASP对HUVECs和RTAECs细胞的活性没有明显影响。2.随着ASP浓度的增加（1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L）,HUVECs和RTAECs细胞释放到培养基中NO水平下降,同时反应脂质氧化水平的MDA水平在HUVECs和RTAECs细胞中逐渐增加。3.随着ASP浓度的增加（1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100nmol/L）,血管内皮细胞胰岛素通路相关蛋白p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、peNOS/eNOS表达逐渐减少。结论:（1）ASP在浓度≤100 nmol/L范围内对血管内皮细胞（HUVECs和RTAECs）无明显毒性,后续实验可在此范围内选择ASP作用浓度。（2）在细胞水平上,ASP可以呈浓度依赖性升高细胞氧化应激水平,抑制PI3K/AKT/eNOS信号通路,导致血管内皮细胞功能障碍。第3章脂肪因子ASP对小鼠主动脉血管内皮功能的影响目的:使用小鼠肥胖模型,探究脂肪因子ASP对小鼠血管内皮功能的影响,从整体水平研究ASP在血管内皮功能障碍发生发展中的作用及机制。方法:1.ASP或ASP中和抗体（AASP）干预实验:我们前期已经成功制备了ASP抗体AASP。在本实验中我们将24只雄性C57BL/6小鼠随机分为4组（每组6只鼠）,分别为Ctrl组、ASP组、HFD组和HFD+AASP组,其中Ctrl组和HFD组分别喂予正常饮食和高脂饮食24周,ASP组喂予正常饮食24周后腹腔注射ASP（0.5μg·g-1·day-1）连续给药4周,HFD+AASP组喂予高脂饮食24周后腹腔注射AASP（0.5μg·g-1·day-1）连续给药4周。（1）监测小鼠的身体测量学指标（如体重、体长等）。（2）检测小鼠血清中ASP的水平、糖脂代谢包括血糖、T-CHO、TG、HDL-C、ITT和GTT以及主动脉中NO以及MDA的含量。（3）通过超声检测小鼠血管舒张功能、血流动力学,通过MRBP大小鼠无创血压仪检测小鼠的血压。（4）通过Western blot检测主动脉中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS的表达情况。2.ASP缺陷小鼠实验:我们前期已经成功构建了脂肪组织ASP缺陷鼠（ASP-deficiency）。将12只野生型（WT）雄性C57BL/6鼠随机分为WT组和HFD+WT组。WT组喂予正常饮食24周,HFD+WT组喂予高脂饮食24周。将12只ASP缺陷鼠（ASP-deficiency）雄性C57BL/6鼠随机分为两组分别为正常饮食（ASP-deficiency）和高脂饮食（HFD+ASP-deficiency）组,ASP-deficiency组喂予正常饮食24周,HFD+ASP-deficiency组喂予高脂饮食24周。（1）监测小鼠的身体测量学指标（如体重、体长等）。（2）检测小鼠血清中ASP水平、糖脂代谢指标（如血糖、ITT、GTT、T-CHO、TG、HDL-C）以及主动脉中NO以及MDA的含量。（3）通过超声检测小鼠血管舒张功能、血流动力学,通过MRBP大小鼠无创血压仪检测小鼠的血压。（4）通过Western blot检测主动脉中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS的表达情况。结果:1.ASP或AASP干预实验（1）小鼠身体测量学指标:正常饮食C57BL/6小鼠给予ASP后小鼠体重显著增加。高脂饮食的肥胖小鼠中给予AASP后,小鼠的体重明显下降。（2）小鼠血清ASP水平、糖脂代谢指标以及NO、MDA水平改变:与Ctrl组相比,HFD组血清ASP、血糖、T-CHO、TG以及主动脉组织MDA水平显著上升而血清HDL-C和血管组织中NO水平显著下降,而且小鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐量受损明显;ASP干预组各项生化指标同HFD组相似;但AASP干预（HFD+AASP）4周后,小鼠各项生化指标基本恢复正常水平,葡萄糖耐量和胰岛素耐量异常也得到显著改善。（3）小鼠血管舒张功能和血压水平及血流动力学改变:与Ctrl组相比,ASP、HFD、HFD+AASP组由硝普钠（SNP）介导的血管非内皮依赖性舒张功能均没有明显影响,而ASP组和HFD组由乙酰胆碱（Ach）和胰岛素（INS）介导的血管内皮依赖性舒张功能显著下降;与HFD组相比,HFD+AASP组小鼠的由Ach和INS介导的血管内皮依赖性舒张功能显著改善。此外,与Ctrl组比,尽管HFD组的血压升高,但ASP、HFD和HFD+AASP组颈动脉流速无明显差异,分别给予SNP、Ach和INS等血管扩张药,ASP、HFD、HFD+AASP组的血压和颈动脉流速无明显变化。（4）主动脉内皮胰岛素信号通路相关蛋白的表达改变:与Ctrl组相比,ASP和HFD组可负性调节PI3K/AKT/eNOS通路;与HFD组比较,给予AASP后,可以逆转高脂诱导的该通路的抑制。2.ASP缺陷小鼠实验（1）小鼠身体测量学指标:与WT组相比,HFD+WT组小鼠的体重明显升高,而ASP-deficiency和HFD+ASP-deficiency组的体重无明显差异。（2）小鼠血清ASP水平、糖脂代谢指标以及血管中NO、MDA水平改变:与WT组相比,HFD+WT组中除了NO和HDL-C水平下降外其他指标均显著升高,说明HFD导致了小鼠糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗（IR）;ASPdeficiency和HFD+ASP-deficiency组小鼠血清ASP水平下降,其他血清糖脂代谢指标以及血管组织中NO和MDA水平无明显差异但显著低于HFD+WT组。（3）小鼠血管舒张功能和血压水平及血流动力学改变:与WT组相比,ASP-deficiency、HFD+WT和HFD+ASP-deficiency组的由SNP介导的非内皮依赖性血管舒张功能均没有明显影响,且ASP-deficiency和HFD+ASPdeficiency组由Ach和INS介导的血管内皮依赖性舒张功能也无明显差异,而HFD+WT组的血管内皮依赖性舒张功能显著下降。与WT组比,ASPdeficiency和HFD+ASP-deficiency血压无明显差异,HFD+WT组的血压升高,ASP-deficiency、HFD+WT和HFD+ASP-deficiency组颈动脉流速无明显差异,给予血管扩张药（SNP,Ach和INS）后,ASP-deficiency、HFD+WT和HFD+ASP-deficiency组的血压和颈动脉流速均无明显变化。（4）主动脉内皮胰岛素信号通路相关蛋白的表达改变:与WT组相比,HFD+WT组负性调控PI3K/AKT/eNOS通路,C57BL/6小鼠ASP缺陷对PI3K/AKT/eNOS通路无明显影响,但ASP缺陷可以逆转高脂对PI3K/AKT/eNOS通路的抑制。结论:（1）ASP可导致小鼠糖脂代谢紊乱和血管内皮功能障碍及胰岛素抵抗（IR）。（2）AASP可改善HFD诱导的糖脂代谢紊乱和血管内皮功能障碍及IR。（3）脂肪组织ASP缺陷也可改善HFD诱导的糖脂代谢紊乱和血管内皮功能障碍及IR。第4章脂肪因子ASP对血管内皮细胞线粒体动力学稳态的影响目的:根据第三章研究结果,ASP可以引起体内糖脂代谢紊乱和氧化应激水平升高,从而导致血管内皮功能障碍。然而,体内氧化应激水平升高可能与线粒体功能障碍介导的ROS升高密切相关,而线粒体动力学稳态是维持线粒体正常功能的主要方式。因此本章拟从细胞和动物水平研究ASP对线粒体动力学稳态的影响,进一步理清ASP诱导的血管内皮功能障碍与线粒体动力学稳态之间的关系。方法:1.细胞实验:设置一系列ASP浓度梯度（1 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L）分别加入到HUVECs和RTAECs细胞培养基中作用48 h,最后用胰岛素（100 nmol/L）作用细胞30 min。Western blot检测细胞内DRP1（线粒体分裂蛋白）、DRP1的Ser-616和Ser-637的磷化蛋白水平以及MFN2（线粒体融合蛋白）的表达水平。2.动物实验:（1）动物实验分组同第三章方法1。分别检测Ctrl组、ASP组、HFD组和HFD+AASP四组小鼠中DRP1和MFN2水平。（2）动物实验分组同第三章方法2。分别检测WT组、HFD+WT组,ASP-deficiency组和HFD+ASP-deficiency组小鼠中DRP1和MFN2水平。结果:1.细胞实验（1）随着ASP浓度的升高,HUVECs和RTAECs中DRP1表达逐渐上调,而MFN2水平逐渐下调,出现了线粒体动力学稳态失衡。（2）随着ASP浓度的升高,同总DRP1一样,HUVECs和RTAECs中DRP1的Ser-616和Ser-637的磷化水平均显著升高。2.动物实验（1）同HFD组一样,C57BL/6小鼠给予ASP后也可显著升高血管组织中DRP1的表达,下调MFN2的表达,导致线粒体动力学稳态失衡。（2）ASP-deficiency在正常饮食下不影响血管组织DRP1和MFN2的表达,但在高脂饮食下,ASP-deficiency可逆转HFD诱导的DRP1上调以及MFN2下调,恢复线粒体动力学稳态。结论:（1）ASP可导致血管内皮细胞线粒体动力学稳态失衡。（2）AASP和ASP缺陷均可改善肥胖状态下线粒体动力学稳态失衡。（3）ASP诱导血管内皮功能障碍可能与线粒体动力学稳态失衡有密切关系。第5章脂肪因子ASP导致血管内皮功能障碍的线粒体动力学机制及意义目的:根据第四章研究结果发现,ASP可导致血管内皮功能障碍且可诱导线粒体动力学稳态失衡,那么ASP诱导的线粒体动力学稳态失衡是不是导致血管内皮功能障碍的机制呢?此外,抑制线粒体fission来恢复线粒体动力学稳态是否对ASP诱导的血管内皮功能障碍具有改善作用?因此本章以线粒体分裂蛋白DRP1为靶标,通过给予DRP1药理性抑制剂MDIVI-1抑制DRP1活性或通过sh RNA干扰下调DRP1表达探究ASP诱导血管内皮功能障碍的分子机制及其潜在的临床转化价值。方法:1.DRP1药理性抑制实验:将HUVECs和RTAECs分为6组,分别为Ctrl组、棕榈酸盐（PA:0.25 mmol/L）组、ASP（50 nmol/L）组、PA+ASP组、PA+ASP+MDIVI-1（10μmol/L）组、PA+ASP+DMSO组,其中PA、ASP作用细胞36 h,再接着用MDIVI-1作用12 h,最后用胰岛素（100nmol/L）作用细胞30 min。（1）采用共聚焦显微镜观察线粒体的形态和结构;（2）Western blot检测DRP1和MFN2水平;（3）NO水平检测;（4）MDA的含量检测;（5）胰岛素信号通路检测:Western blot法检测血管内皮细胞中PI3K/AKT/eNOS通路蛋白及磷酸化蛋白水平。2.DRP1敲减实验:根据DRP1靶点设计出三种针对DRP1不同靶位的敲减慢病毒。将含有DRP1-sh RNA1、DRP1-sh RNA2、DRP1-sh RNA3和Scrambled sh RNA的慢病毒感染HUVECs和RTAECS,孵育72 h,通过Western blot检测DRP1敲低效率,与Ctrl组比较确定最佳DRP1敲减病毒。将HUVECs和RTAECs分为Scrambled sh RNA和DRP1-sh RNA组,每组又细分为4个亚组,分别为Ctrl组、PA（0.25 mmol/L）组、ASP（50 nmol/L）组和PA+ASP组。其中PA、ASP作用细胞48 h,最后用胰岛素（100 nmol/L）作用细胞30 min。（1）采用共聚焦显微镜观察线粒体的形态和结构;（2）Western blot检测DRP1和MFN2水平;（3）NO水平检测;（4）MDA的含量检测;（5）胰岛素信号通路检测:Western blot法检测血管内皮细胞中PI3K/AKT/eNOS通路蛋白及磷酸化蛋白水平。结果:1.DRP1药理性抑制实验（1）线粒体形态结构改变:PA和ASP分别处理血管内皮细胞均可导致线粒体fission,表现为线粒体碎裂,分支变短,两者合用后,线粒体fission更加显著;给予MDIVI-1后,MDIVI-1可以显著对抗高脂状态下ASP诱导的线粒体fission以及DRP1表达的上调和MFN2的下调。（2）给予MDIVI-1后,MDIVI-1可以显著逆转高脂状态下ASP诱导的NO水平的下降以及MDA水平的升高。（3）给予MDIVI-1后,MDIVI-1可以显著逆转高脂状态下ASP诱导的PI3K/AKT/eNOS通路蛋白的下调,改善血管内皮功能障碍。2.DRP1敲减实验:（1）通过Western blot检测DRP1沉默效率:与Scrambled sh RNA组相比,DRP1-sh RNA1、DRP1-sh RNA2、DRP1-sh RNA3均可不同程度下调DRP1蛋白表达,但以DRP1-sh RNA1最为显著,因此DRP1-sh RNA1用于后续DRP1敲减实验。（2）线粒体的形态结构:DRP1敲减可显著改善PA、ASP和PA+ASP导致的线粒体碎片化,抑制线粒体fission,下调DRP1表达,却上调MFN2表达。（3）DRP1敲减可显著逆转PA、ASP和PA+ASP导致的NO水平的下降以及MDA水平的升高。（4）DRP1敲减可显著对抗PA、ASP和PA+ASP诱导的PI3K/AKT/eNOS通路蛋白的下调,改善血管内皮功能障碍。结论:（1）抑制DRP1活性可以纠正高脂模型中ASP诱导的血管内皮细胞线粒体动力学稳态失衡,降低氧化应激水平从而改善血管内皮功能。（2）DRP1敲减可以纠正高脂模型中ASP诱导的血管内皮细胞线粒体动力学稳态失衡,降低氧化应激水平从而改善血管内皮功能。（3）ASP导致血管内皮功能障碍是由于线粒体动力学稳态失衡所致,故纠正ASP诱导的线粒体动力学稳态失衡可能是肥胖及其相关的CVD防治的有效途径。