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禽网状内皮组织增殖病(Reticuloendotheliosis,RE)是由反转录病毒科的网状内皮组织增殖病病毒(REV)引起的一系列病理性综合征,其主要感染宿主为火鸡、鸡、鸭、鹅以及其他禽类。REV引起的病理症状主要包括急性网状细胞瘤、矮小综合征以及慢性淋巴组织瘤等。由于REV作用的靶细胞主要为淋巴细胞和网状细胞,能够损害机体的免疫功能,降低机体的免疫应答能力,尤其是幼禽感染REV时,会发生明显的免疫抑制,继发其它感染。目前,对RE尚无有效的防控手段,只能通过对REV抗原或抗体检测,淘汰病鸡,净化鸡群。为了准确了解REV感染情况,及早淘汰患病鸡,阻止REV传播,减少REV对家禽养殖造成的损失,具有操作简单快速、敏感性高等优点的酶联免疫吸附试验是最佳检测手段,但由于REV的高变异性,现有的试剂盒难以准确地检测并且价格昂贵,无法适于大规模的临床使用。因此,建立操作简单快速、敏感性高、特异性强并且成本低适用于大规模临床使用的REV抗体ELISA检测试剂盒具有重要意义。REV-Gp90蛋白位于病毒囊膜的表面,含有线性表位和构象表位,能够激发宿主产生中和抗体,是病毒的免疫显性蛋白。抗原表位是抗原分子上能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够被其识别的一个免疫活性区,多表位串联含有更广谱的表位信息,可以避免因毒株变异而导致的检测失败,从而提供更准确、更快速的检测,为疾病的防控净化提供了科学基础。本研究根据REV的分子病毒学和免疫学相关信息,采用表位预测法分析预测REV囊膜蛋白Gp90段的抗原表位,并串联其中无突变的抗原表位基因,在保证串联表位基因高度保守的同时,又不会丧失其应有的抗原性。由生物公司进行串联表位基因的合成,并构建重组质粒pET-32a-串联表位以及构建含有重组质粒的表达菌种。在最优条件下大量表达表位串联蛋白,重组蛋白通过SDS-PAGE电泳验证,结果显示重组蛋白折叠成包涵体,且蛋白大小(36KD)符合预期。对表位串联蛋白进行纯化复性后通过ELISA和Western Blot检测,结果显示表位串联蛋白具有良好的敏感性和特异性。以纯化复性表位串联蛋白为包被抗原,建立REV抗体ELISA检测方法。按照ELISA常规操作方法,每次设定一个工作条件作为变量对ELISA检测方法进行优化,确定最佳抗原包被浓度为20μg/mL、抗血清最佳稀释倍数为200倍,孵育时间为1.5h、最佳抗原包被液为碳酸盐缓冲液、最佳封闭液为5%的脱脂奶粉、最佳封闭时间为2h、二抗最佳稀释倍数为8000倍,孵育时间为0.75h、最佳显色时间为10min。通过对50份阴性血清的检测,确定了其临界值为0.269;通过对4份REV阳性血清检测,确定板内变异系数为3.49%-6.36%,板间变异系数为6.10%-9.41%,说明其重复性良好。使用优化好的ELISA检测方法对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、马立克氏病毒(MDV)、圆圈病毒3型(GyV3)、鸡传染性贫血病毒(CAV)以及新城疫病毒(NDV)等家禽常见病病毒阳性血清进行检测,结果显示检测抗原不与上述血清发生反应,说明本试剂盒特异性良好。使用优化好的试剂盒与IDEXX试剂盒分别对148份临床样本进行检测,本试剂盒和IDEXX试剂盒检测阳性率分别为47.97%和41.89%,表明与IDEXX试剂盒相比,本检测方法具有更高的敏感性。此外,通过本检测方法对山东省多个地区养殖场的临床血清样品进行检测,发现其阳性检出率为45.5%,说明我省鸡群中REV感染率较高,REV亟待净化。本研究成功表达REV表位串联蛋白,并以表位串联蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA工作条件,构建的REV抗体ELISA检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强,重复性好等优点,为我国检测净化REV,促进家禽养殖业健康发展提供了技术保障。