黄淮地区大豆胞囊线虫抗源筛选及致病相关基因的抗性鉴定

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大豆胞囊线虫病(Soybean Cyst Nematode)是一种世界性大豆病害,全球每年由于大豆胞囊线虫病造成的经济损失可达数亿美元。防治大豆胞囊线虫病通常采用轮作、种植抗病品种、化学防治、生物防治等措施。由于轮作要求间隔年份较高;化学防治容易产生农药残留;生物防治环保,但不宜大面积推广,因此,传统的大豆胞囊线虫防治工作剩下种植抗病品种最为经济有效。近年来,随着生物信息技术的飞速发展,通过表达大豆胞囊线虫致死基因ds RNA的大豆转基因技术为防治大豆胞囊线虫提供了新的思路。鉴于此,对于大豆胞囊线虫的防治,需要采取综合治理的策略,本研究利用抗病品种和转基因技术两个方面,分别进行了大豆抗胞囊线虫种质资源筛选和大豆胞囊线虫致病相关基因的鉴定工作,取得的主要研究结果如下:1.大豆胞囊线虫抗源筛选方面:应用大豆胞囊线虫(SCN)悬浮液接种法,先后对来自中国7个省市的350份大豆种质资源进行了大豆胞囊线虫1号生理小种的抗性鉴定,共筛选出3份高抗种质,分别是中品03-5368、邯6192、沧豆6号;6份中抗种质,分别是中作50365-1、周01-14、周01015-1、冀01S56、沧豆7号、汾9877-10。筛选出来的抗病种质均为黄种皮,农艺性状优良,单产较高。3份高抗种质经过多年鉴定抗性表现一致,可供生产和抗病育种应用;6份中抗种质尚需进一步鉴定。2.大豆胞囊线虫致病相关基因抗性鉴定方面:(1)应用发根农杆菌介导的大豆“复合体”植株转化系统,选择生长5 d的大豆幼苗、菌液接种浓度OD600值为0.8、23℃恒温、16 h/d光照保湿条件下对35个大豆基因型进行了筛选。研究发现,不同大豆基因型的发根诱导率、发根数、转化效率之间有很大差异。选择发根诱导率大于60%、发根数1.6条以上的21个大豆基因型进行GUS基因组织化学染色。结果表明,5个大豆基因型Y091、KF1、Z184、P108、L010 GUS基因转化效率较高,分别为96.2%、91.4%、91.7%、87.5%、86.4%。进一步对5个大豆基因型进行RT–PCR分析,GUS基因在5个大豆基因型毛状根中均得到了转录。表明大豆基因型Y091、KF1、Z184、P108、L010是发根农杆菌转化的理想受体材料。(2)应用发根农杆菌介导的大豆“复合体”植株转化系统,选择大豆基因型KF1分别对大豆胞囊线虫基因cgh-1、cpl-1、npp-17、vha-14 RNAi片段进行毛状根的诱导,形成的“复合体”植株接种大豆胞囊线虫4号生理小种后,进行功能验证。转基因大豆根系RT-PCR分析表明4个胞囊线虫基因RNAi片段分别在大豆毛状根中得到正确转录。转基因大豆根系生物活性鉴定结果表明4个胞囊线虫基因RNAi片段均能够显著降低每g根上胞囊数、每g根上虫卵数,其中vha-14能同时显著降低单个胞囊内含有卵的个数;转基因大豆根系着生胞囊寄生指数分析结果表明4个胞囊线虫基因RNAi片段均使寄生指数(IP)判定级别由中感变为了中抗。综合生物活性和寄生指数分析结果说明4个胞囊线虫基因RNAi片段均能够降低一定数目的胞囊,但由于寄生指数(IP)没有达到高抗水平,以上基因尚不具备生产应用价值。为了进一步确定胞囊线虫取食转基因大豆根系后,RNAi在线虫体内表达情况,分别对转基因根系着生胞囊进行RT-PCR和real-time PCR分析,均没有检测到RNAi效应,推测受到RNAi的胞囊线虫已经死亡,未来的工作需补充胞囊线虫取食转基因根系不同时期切片,检测胞囊线虫致死表型。
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