【摘 要】
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烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是免疫缺陷患者或免疫机能减退人群的重要威胁,可通过空气传播感染宿主的呼吸道及肺部,引起哮喘、肺曲霉病等严重疾病,近年来感染率与死亡率仍处于上升的趋势。烟曲霉入侵宿主时可通过分生孢子与宿主的补体调节因子结合以激活补体系统相关通路从而引发宿主的先天免疫反应。然而有研究发现,烟曲霉可通过其外泌的碱性丝氨酸蛋白酶1（alkaline protease 1
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烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是免疫缺陷患者或免疫机能减退人群的重要威胁,可通过空气传播感染宿主的呼吸道及肺部,引起哮喘、肺曲霉病等严重疾病,近年来感染率与死亡率仍处于上升的趋势。烟曲霉入侵宿主时可通过分生孢子与宿主的补体调节因子结合以激活补体系统相关通路从而引发宿主的先天免疫反应。然而有研究发现,烟曲霉可通过其外泌的碱性丝氨酸蛋白酶1（alkaline protease 1,Alp1）裂解宿主补体系统中多种组分（如C3b、C4b、C5等）以及抗体Ig G以逃逸宿主先天免疫防御。C3是补体系统三条通路的核心蛋白,也是补体激活级联放大效应的关键组分。Alp1对C3是否具有直接裂解作用未有报道,且其对C3等补体组分的裂解作用是否具有局部构象特异性或肽键特异性尚不清楚。本论文从Alp1裂解人补体C3的生化性质鉴定入手,并结合生物信息学分析,期望通过结构生物学手段捕捉到Alp1裂解C3的初始状态,进而获得Alp1活性状态的构象,为以Alp1为靶点设计药物抑制其丝氨酸蛋白酶活性阻断其对宿主的免疫逃逸提供实验依据。为了避免已有报道中采用原核表达系统遇到的问题,我们选择pPIC9k质粒构建重组表达载体在毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株中诱导表达。我们在Alp1的N端和C端分别添加了Strep II及6×His标签以提高蛋白纯度并便于鉴定发生自裂解后处于激活态的Alp1;补体C3则先后通过PEG沉淀、阴离子及阳离子交换层析、凝胶排阻层析等多种手段从人血清中直接纯化获得。我们运用负染电镜的方法分别重构得到了分子量185 k Da的C3及32 k Da的Alp1激活态的三维结构;采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质免疫印迹、负染电镜等实验手段摸索并优化适于捕捉C3-Alp1互作状态的温度、摩尔比、时间等孵育条件,以及采用甲醛和戊二醛对该互作过程进行瞬时交联的条件,验证了C345C结构域是Alp1识别的靶点之一,暗示Alp1对C3、C4、C5的裂解作用;同时运用生物信息学手段对Alp1进行同源建模及活性位点预测,构建了Alp1的S349A突变体,并验证了S349是其重要的催化活性位点及自裂解抑制位点。本论文为下一步明确Alp1对C3等补体蛋白的裂解机制以及基于Alp1及其酶原形式的结构特征进行药物筛选及设计奠定了重要的前期基础。
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