论文部分内容阅读
目的:
拟在体内水平建立Ⅳ型胶原酶诱导的小鼠自发性急性脑出血(ICH)模型，在体外水平建立血色素及铁死亡诱导剂诱导的神经细胞损伤模型，探索黄芩苷对ICH模型小鼠的治疗作用及对神经细胞损伤模型的保护作用，并验证其减少神经细胞铁死亡现象发生的治疗机制。
方法:
体内实验使用雄性C57小鼠。将48只小鼠随机平均分为3组:假手术组(Sham)、模型组(Mod)、黄芩苷治疗组(Bai)，每组16只。配置浓度为0.7mg/mL的Ⅳ型胶原酶工作液，除假手术外，其余两组均采用脑内注射Ⅳ型胶原酶进行诱导造模。Bai治疗组于造模完成后的2h内灌胃给予20mg/kg的黄芩苷溶液，Mod组与Sham组于造模完成2h内灌胃给予等体积生理盐水。造模完成后第二天起每天上午Bai组灌胃给予20mg/kg黄芩苷溶液，Mod组与Sham组给予等体积生理盐水，持续三天。同时在造模完成后的三天内每天进行一次行为学检测，包括爬杆实验和转棒实验。三天给药及行为学检测结束后对小鼠进行取材，拍摄脑组织切片高清扫描照片并制作HE染色的脑组织石蜡切片以比较出血灶大小，制作脑组织冰冻切片并进行FJB免疫荧光染色以比较神经元损伤情况，制作脑组织冰冻切片并进行普鲁士蓝染色以比较局部组织铁离子沉积情况，制作脑组织匀浆并提取RNA以进行铁死亡相关基因的PCR验证，最后制作HE染色的肝肾组织切片以比较肝肾毒性。
体外实验使用PC12及SH-SY5Y细胞，采用Hemin(血色素)诱导细胞株(PC12)的损伤，构建体外脑出血细胞损伤模型，并采用Erastin(铁死亡诱导剂)诱导细胞株(PC12、SH-SY5Y)损伤，构建体外神经元铁死亡细胞模型。通过MTT实验及活死细胞染色实验以评价黄芩苷对于两种损伤细胞模型的保护效果。通过细胞免疫荧光染色实验及PCR验证实验以研究黄芩苷对细胞损伤模型保护效果的作用机制。
结果:
行为学实验结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间发生缩短并且总掉落次数增加，爬杆实验中杆上转头时间显著延长并且总爬行时间显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05及P＜0.01)。而Bai组与Sham组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间无明显改变并且总掉落次数接近，爬杆实验中杆上转头时间及总爬行时间均没有差异。同时Bai组与Mod组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间明显延长，爬杆实验中总爬行时间出现了明显缩短，差异具体有统计学意义(P＜0.05及P＜0.01)。
脑组织出血灶大小比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，右侧脑组织存在明显的肉眼可见出血灶。而Bai组与Mod组相比，出血灶面积大小得到了明显的控制。
脑组织切片染色结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，脑组织切片上FJB荧光染色阳性数量明显增多，普鲁士蓝染色阳性区域明显增多，GPX4免疫荧光阳性染色亮度明显增强。而Bai组与Mod组小鼠相比，脑组织内FJB荧光染色阳性数量明显减少，蓝色的普鲁士蓝染色阳性表现区域明显减小，GPX4免疫荧光阳性染色亮度变化不大。
脑组织内铁死亡相关基因PCR定量比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比Hmox1、SLC3A2、DMT1的表达均有上调，其差异均存在统计学意义(P＜0.01)。而在GPX4、Hmox1、SLC3A2、DMT1四个基因的表达中，Bai组小鼠与Mod组小鼠相比有显著性差异，其差异存在统计学意义(P＜0.01)。
体外实验结果:损伤模型组细胞与空白对照组细胞相比，MTT细胞存活率结果出现显著降低，活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显著增多，免疫荧光染色结果显示GPX4、Nrf2、HO-1的表达升高，PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2、TFRC、SLC11A2的表达水平均出现显著改变，其差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。而在进行黄芩苷干预之后，给药组细胞与损伤模型组细胞相比，MTT细胞存活率结果出现剂量依赖性的显著提高，活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显著降低，免疫荧光染色结果显示HO-1的阳性表达降低，PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2L、TFRC、SLC11A2的表达能回复至正常水平，其差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。
结论:
在体内实验中，黄芩苷能够改善ICH模型小鼠的运动能力，减小ICH小鼠的脑内出血灶大小，保护其脑组织内神经细胞。并能够减少ICH小鼠脑组织内铁离子的沉积，改变脑组织内铁死亡相关基因的表达，从而起到降低铁死亡发生可能性的作用机制。在体外试验中，黄芩苷能够提高神经细胞脑出血及铁死亡损伤模型的存活率，并且能够影响铁死亡相关基因的表达结果，从而表明黄芩苷能够保护神经细胞免于损伤，并对于铁死亡现象的发生能够产生抑制作用。
拟在体内水平建立Ⅳ型胶原酶诱导的小鼠自发性急性脑出血(ICH)模型，在体外水平建立血色素及铁死亡诱导剂诱导的神经细胞损伤模型，探索黄芩苷对ICH模型小鼠的治疗作用及对神经细胞损伤模型的保护作用，并验证其减少神经细胞铁死亡现象发生的治疗机制。
方法:
体内实验使用雄性C57小鼠。将48只小鼠随机平均分为3组:假手术组(Sham)、模型组(Mod)、黄芩苷治疗组(Bai)，每组16只。配置浓度为0.7mg/mL的Ⅳ型胶原酶工作液，除假手术外，其余两组均采用脑内注射Ⅳ型胶原酶进行诱导造模。Bai治疗组于造模完成后的2h内灌胃给予20mg/kg的黄芩苷溶液，Mod组与Sham组于造模完成2h内灌胃给予等体积生理盐水。造模完成后第二天起每天上午Bai组灌胃给予20mg/kg黄芩苷溶液，Mod组与Sham组给予等体积生理盐水，持续三天。同时在造模完成后的三天内每天进行一次行为学检测，包括爬杆实验和转棒实验。三天给药及行为学检测结束后对小鼠进行取材，拍摄脑组织切片高清扫描照片并制作HE染色的脑组织石蜡切片以比较出血灶大小，制作脑组织冰冻切片并进行FJB免疫荧光染色以比较神经元损伤情况，制作脑组织冰冻切片并进行普鲁士蓝染色以比较局部组织铁离子沉积情况，制作脑组织匀浆并提取RNA以进行铁死亡相关基因的PCR验证，最后制作HE染色的肝肾组织切片以比较肝肾毒性。
体外实验使用PC12及SH-SY5Y细胞，采用Hemin(血色素)诱导细胞株(PC12)的损伤，构建体外脑出血细胞损伤模型，并采用Erastin(铁死亡诱导剂)诱导细胞株(PC12、SH-SY5Y)损伤，构建体外神经元铁死亡细胞模型。通过MTT实验及活死细胞染色实验以评价黄芩苷对于两种损伤细胞模型的保护效果。通过细胞免疫荧光染色实验及PCR验证实验以研究黄芩苷对细胞损伤模型保护效果的作用机制。
结果:
行为学实验结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间发生缩短并且总掉落次数增加，爬杆实验中杆上转头时间显著延长并且总爬行时间显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.05及P＜0.01)。而Bai组与Sham组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间无明显改变并且总掉落次数接近，爬杆实验中杆上转头时间及总爬行时间均没有差异。同时Bai组与Mod组小鼠相比，转棒实验中首次掉落时间明显延长，爬杆实验中总爬行时间出现了明显缩短，差异具体有统计学意义(P＜0.05及P＜0.01)。
脑组织出血灶大小比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，右侧脑组织存在明显的肉眼可见出血灶。而Bai组与Mod组相比，出血灶面积大小得到了明显的控制。
脑组织切片染色结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比，脑组织切片上FJB荧光染色阳性数量明显增多，普鲁士蓝染色阳性区域明显增多，GPX4免疫荧光阳性染色亮度明显增强。而Bai组与Mod组小鼠相比，脑组织内FJB荧光染色阳性数量明显减少，蓝色的普鲁士蓝染色阳性表现区域明显减小，GPX4免疫荧光阳性染色亮度变化不大。
脑组织内铁死亡相关基因PCR定量比较结果:Mod组小鼠与Sham组小鼠相比Hmox1、SLC3A2、DMT1的表达均有上调，其差异均存在统计学意义(P＜0.01)。而在GPX4、Hmox1、SLC3A2、DMT1四个基因的表达中，Bai组小鼠与Mod组小鼠相比有显著性差异，其差异存在统计学意义(P＜0.01)。
体外实验结果:损伤模型组细胞与空白对照组细胞相比，MTT细胞存活率结果出现显著降低，活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显著增多，免疫荧光染色结果显示GPX4、Nrf2、HO-1的表达升高，PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2、TFRC、SLC11A2的表达水平均出现显著改变，其差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。而在进行黄芩苷干预之后，给药组细胞与损伤模型组细胞相比，MTT细胞存活率结果出现剂量依赖性的显著提高，活死细胞染色结果显示死亡细胞数量显著降低，免疫荧光染色结果显示HO-1的阳性表达降低，PCR验证结果显示GPX4、NFE2L2、Hmox1、SLC7A11、SLC3A2L、TFRC、SLC11A2的表达能回复至正常水平，其差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。
结论:
在体内实验中，黄芩苷能够改善ICH模型小鼠的运动能力，减小ICH小鼠的脑内出血灶大小，保护其脑组织内神经细胞。并能够减少ICH小鼠脑组织内铁离子的沉积，改变脑组织内铁死亡相关基因的表达，从而起到降低铁死亡发生可能性的作用机制。在体外试验中，黄芩苷能够提高神经细胞脑出血及铁死亡损伤模型的存活率，并且能够影响铁死亡相关基因的表达结果，从而表明黄芩苷能够保护神经细胞免于损伤，并对于铁死亡现象的发生能够产生抑制作用。