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背景
寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)是一种黄病毒属病毒,1947年首次在乌干达寨卡森林哨兵猴体内分离,之后仅有散在发病报道.直到2007年位于南太平洋密克罗尼西亚的雅浦岛发生寨卡病毒大爆发,有严重格林-巴利综合症并发症报道.2015年巴西确诊寨卡病毒感染病例,首次报道孕妇感染后造成胎儿小头症、胎儿畸形.2016年2月世界卫生组织宣布寨卡病毒为公众健康紧急事件,对于寨卡病毒感染目前没有批准的治疗药物或预防性疫苗,因此急需发展有效的疫苗.寨卡病毒E蛋白是主要的中和抗原,正在研制的寨卡病毒疫苗多基于E蛋白抗原设计.寨卡病毒重组DNA疫苗被报道在小鼠、恒河猴体内诱导强的免疫应答并提供完全保护.基于非复制痘苗病毒的C型肝炎病毒疫苗在恒河猴可诱导强的免疫应答,目前未有基于非复制型痘苗病毒载体的寨卡病毒疫苗报道.
研究目的
本研究构建含寨卡病毒prME基因的重组DNA疫苗、含寨卡病毒E基因的重组非复制型痘苗病毒疫苗,在BALB/c小鼠模型上采用不同免疫策略评价其免疫原性及对BALB/c、Ifnar-/-小鼠感染ZIKV的保护效果.
研究方法与结果
一、寨卡病毒重组DNA疫苗与非复制型痘苗病毒疫苗的构建与表达鉴定
合成密码子优化的ZIKV结构蛋白prME序列并将其信号肽替换为日本乙型脑炎病毒(JEV)信号肽,采用pVRC载体构建重组DNA疫苗(VRC-prME),通过测序确定构建正确.然后体外瞬时转染重组质粒,运用鼠源抗-ZIKV-E抗体进行Westernblot检测,结果表明VRC-prME可表达ZIKV-E蛋白.
将野生型ZIKVE基因序列插入痘苗病毒的同源重组质粒JSC1175-LacZ,在鸡胚成纤维细胞中同源重组构建,筛选获得重组非复制型痘苗病毒疫苗(NTV-E),测序确定构建正确.Westernblot检测结果表明:NTV-E感染的细胞裂解物中可检出ZIKV-E蛋白表达.
二、VRC-prME、NTV-E重组疫苗免疫诱导抗原特异体液免疫应答
选取6周龄雌性BABL/c小鼠进行免疫,运用ELISA检测小鼠血清中特异IgG抗体,用微量中和实验检测针对ZIKV的中和抗体滴度,用标记荧光素酶的痘苗病毒检测痘苗病毒中和抗体的方法检测免疫血清针对痘苗病毒的中和抗体.结果显示,加强免疫4周后,VRC-prME、NTV-E同源免疫、联合免疫均可诱导高滴度的针对ZIKV-E特异的IgG与一定滴度的抗ZIKV中和抗体,组间无显著性差异.同时检测针对痘苗病毒的IgG抗体,结果显示,NTV-E与NTV载体对照组同源免疫均产生较高滴度的针对痘苗病毒的抗体与抗痘苗病毒中和抗体.VRC-prME初免NTV加强后,抗痘苗病毒抗体显著提高.
三、筛选ZIKV-E特异性H2-Kd限制性表位肽
设计并合成覆盖ZIKV-E全长的99条15多肽池(前后肽重叠10肽),取VRC-prME加强免疫组的Balb/C小鼠(H2-Kd)脾细胞,以ZIKV-E肽池为刺激物,运用ELISPOT检测E蛋白特异的优势肽,矩阵分析确定一条刺激活性最强的H2-Kd限制性表位单肽(VRSYCYEASISDMAS).
四、VRC-prME、NTV-E重组疫苗免疫诱导抗原特异细胞免疫应答
以筛选的ZIKVE-特异的优势肽、NTV痘苗病毒为刺激物,取加强免疫2周后小鼠脾细胞进行IFN-γELISPOT检测.结果显示VRC-prME同源免疫、NTV-E同源免疫、VRC-prM/NTV-E联合免疫均诱导与对照组有显著性差异的ZIKVE特异的T细胞应答.与单独NTV-E免疫相比,VRC-prME同源免疫诱导较高水平ZIKVE-特异T细胞应答(约1000SFU/million),联合免疫诱导ZIKVE-特异T细胞免疫应答水平最高(约2800SFU/million).针对痘苗病毒的T细胞免疫应答结果显示,单剂量或两剂量NTV免疫均可诱导一定的痘苗病毒特异的T细胞应答,但组间无显著性差异.
五、VRC-prME、NTV-E重组疫苗在小鼠体内保护效果评价
VRC-prME、NTV-E同源免疫和异源免疫BALB/c、Ifnar-/-小鼠,免疫后2周进行腹腔攻毒,攻毒后一定时间采集血液,取大脑、脾脏进行qRT-PCR检测病毒载量,以此评价疫苗保护效果.结果显示,VRC-prME同源免疫、VRC-prME/NTV-E异源免疫组BALB/c小鼠血清、大脑、脾脏中未检测到病毒载量,而NTV-E同源免疫组病毒载量与对照组无显著性差异.VRC-prME同源免疫和NTV-E同源免疫保护Ifnar-/-小鼠未致死,VRC-prME同源免疫组小鼠血清、大脑、脾脏中检测到较对照组显著性低的病毒载量,NTV-E同源免疫组小鼠血清、大脑中检测到显著性低的病毒血症,而脾脏中病毒水平与对照组无显著性差异.
结论
本研究构建了重组DNA疫苗(VRC-prME)、非复制型痘苗病毒载体疫苗(NTV-E),以同源免疫、异源免疫策略免疫BALB/c小鼠,首次筛选出一条ZIKVE蛋白特异的H2-Kd表位肽,VRC-prME、NTV-E同源免疫及VRC-prME/NTV-E异源免疫均诱导相似水平的ZIKV-E特异的IgG抗体及中和抗体,但VRC-prME/NTV-E异源免疫较产生最强的T细胞应答,且对BALB/c、Ifnar-/-小鼠感染ZIKV表现保护作用.NTV-E同源免疫可诱导产生高水平的抗痘苗病毒体液免疫(IgG、中和抗体)和细胞免疫应答,明显高于VRC-prME/NTV-E异源免疫.在Ifnar-/-小鼠模型中,VRC-prME同源免疫对ZIKV的免疫保护效果优于NTV-E同源免疫.本研究结果可为ZIKV新型疫苗的进一步研制与临床应用提供参考与技术支持.
寨卡病毒(Zikavirus,ZIKV)是一种黄病毒属病毒,1947年首次在乌干达寨卡森林哨兵猴体内分离,之后仅有散在发病报道.直到2007年位于南太平洋密克罗尼西亚的雅浦岛发生寨卡病毒大爆发,有严重格林-巴利综合症并发症报道.2015年巴西确诊寨卡病毒感染病例,首次报道孕妇感染后造成胎儿小头症、胎儿畸形.2016年2月世界卫生组织宣布寨卡病毒为公众健康紧急事件,对于寨卡病毒感染目前没有批准的治疗药物或预防性疫苗,因此急需发展有效的疫苗.寨卡病毒E蛋白是主要的中和抗原,正在研制的寨卡病毒疫苗多基于E蛋白抗原设计.寨卡病毒重组DNA疫苗被报道在小鼠、恒河猴体内诱导强的免疫应答并提供完全保护.基于非复制痘苗病毒的C型肝炎病毒疫苗在恒河猴可诱导强的免疫应答,目前未有基于非复制型痘苗病毒载体的寨卡病毒疫苗报道.
研究目的
本研究构建含寨卡病毒prME基因的重组DNA疫苗、含寨卡病毒E基因的重组非复制型痘苗病毒疫苗,在BALB/c小鼠模型上采用不同免疫策略评价其免疫原性及对BALB/c、Ifnar-/-小鼠感染ZIKV的保护效果.
研究方法与结果
一、寨卡病毒重组DNA疫苗与非复制型痘苗病毒疫苗的构建与表达鉴定
合成密码子优化的ZIKV结构蛋白prME序列并将其信号肽替换为日本乙型脑炎病毒(JEV)信号肽,采用pVRC载体构建重组DNA疫苗(VRC-prME),通过测序确定构建正确.然后体外瞬时转染重组质粒,运用鼠源抗-ZIKV-E抗体进行Westernblot检测,结果表明VRC-prME可表达ZIKV-E蛋白.
将野生型ZIKVE基因序列插入痘苗病毒的同源重组质粒JSC1175-LacZ,在鸡胚成纤维细胞中同源重组构建,筛选获得重组非复制型痘苗病毒疫苗(NTV-E),测序确定构建正确.Westernblot检测结果表明:NTV-E感染的细胞裂解物中可检出ZIKV-E蛋白表达.
二、VRC-prME、NTV-E重组疫苗免疫诱导抗原特异体液免疫应答
选取6周龄雌性BABL/c小鼠进行免疫,运用ELISA检测小鼠血清中特异IgG抗体,用微量中和实验检测针对ZIKV的中和抗体滴度,用标记荧光素酶的痘苗病毒检测痘苗病毒中和抗体的方法检测免疫血清针对痘苗病毒的中和抗体.结果显示,加强免疫4周后,VRC-prME、NTV-E同源免疫、联合免疫均可诱导高滴度的针对ZIKV-E特异的IgG与一定滴度的抗ZIKV中和抗体,组间无显著性差异.同时检测针对痘苗病毒的IgG抗体,结果显示,NTV-E与NTV载体对照组同源免疫均产生较高滴度的针对痘苗病毒的抗体与抗痘苗病毒中和抗体.VRC-prME初免NTV加强后,抗痘苗病毒抗体显著提高.
三、筛选ZIKV-E特异性H2-Kd限制性表位肽
设计并合成覆盖ZIKV-E全长的99条15多肽池(前后肽重叠10肽),取VRC-prME加强免疫组的Balb/C小鼠(H2-Kd)脾细胞,以ZIKV-E肽池为刺激物,运用ELISPOT检测E蛋白特异的优势肽,矩阵分析确定一条刺激活性最强的H2-Kd限制性表位单肽(VRSYCYEASISDMAS).
四、VRC-prME、NTV-E重组疫苗免疫诱导抗原特异细胞免疫应答
以筛选的ZIKVE-特异的优势肽、NTV痘苗病毒为刺激物,取加强免疫2周后小鼠脾细胞进行IFN-γELISPOT检测.结果显示VRC-prME同源免疫、NTV-E同源免疫、VRC-prM/NTV-E联合免疫均诱导与对照组有显著性差异的ZIKVE特异的T细胞应答.与单独NTV-E免疫相比,VRC-prME同源免疫诱导较高水平ZIKVE-特异T细胞应答(约1000SFU/million),联合免疫诱导ZIKVE-特异T细胞免疫应答水平最高(约2800SFU/million).针对痘苗病毒的T细胞免疫应答结果显示,单剂量或两剂量NTV免疫均可诱导一定的痘苗病毒特异的T细胞应答,但组间无显著性差异.
五、VRC-prME、NTV-E重组疫苗在小鼠体内保护效果评价
VRC-prME、NTV-E同源免疫和异源免疫BALB/c、Ifnar-/-小鼠,免疫后2周进行腹腔攻毒,攻毒后一定时间采集血液,取大脑、脾脏进行qRT-PCR检测病毒载量,以此评价疫苗保护效果.结果显示,VRC-prME同源免疫、VRC-prME/NTV-E异源免疫组BALB/c小鼠血清、大脑、脾脏中未检测到病毒载量,而NTV-E同源免疫组病毒载量与对照组无显著性差异.VRC-prME同源免疫和NTV-E同源免疫保护Ifnar-/-小鼠未致死,VRC-prME同源免疫组小鼠血清、大脑、脾脏中检测到较对照组显著性低的病毒载量,NTV-E同源免疫组小鼠血清、大脑中检测到显著性低的病毒血症,而脾脏中病毒水平与对照组无显著性差异.
结论
本研究构建了重组DNA疫苗(VRC-prME)、非复制型痘苗病毒载体疫苗(NTV-E),以同源免疫、异源免疫策略免疫BALB/c小鼠,首次筛选出一条ZIKVE蛋白特异的H2-Kd表位肽,VRC-prME、NTV-E同源免疫及VRC-prME/NTV-E异源免疫均诱导相似水平的ZIKV-E特异的IgG抗体及中和抗体,但VRC-prME/NTV-E异源免疫较产生最强的T细胞应答,且对BALB/c、Ifnar-/-小鼠感染ZIKV表现保护作用.NTV-E同源免疫可诱导产生高水平的抗痘苗病毒体液免疫(IgG、中和抗体)和细胞免疫应答,明显高于VRC-prME/NTV-E异源免疫.在Ifnar-/-小鼠模型中,VRC-prME同源免疫对ZIKV的免疫保护效果优于NTV-E同源免疫.本研究结果可为ZIKV新型疫苗的进一步研制与临床应用提供参考与技术支持.