论文部分内容阅读
目的多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一种在育龄妇女中常见的生殖内分泌疾病,其重要的临床特征之一是卵泡发育不良及排卵障碍,部分PCOS患者伴有胰岛素抵抗且未来发展成为2型糖尿病风险较高,因此PCOS严重影响了育龄妇女的生育及健康。PCOS的病因至今尚不明确。卵巢颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)与PCOS患者异常的卵泡发育和多种病变有着紧密的关系,对卵泡的生长发育起着至关重要的作用。了解PCOS患者卵巢颗粒细胞功能异常的发病机制可能为识别新的诊断和治疗生物标志物提供线索。在卵巢组织和卵泡液中丰度较高的microRNA(miRNA)是一种特殊的单链小分子RNA,其过度表达或表达的下调通过调节基因的表达参与细胞增殖、分化和凋亡等重要生命活动,提示miRNA可能与PCOS的发生有关。对PCOS患者卵巢颗粒细胞中miRNAs的异常表达及miRNAs调节PCOS的发病的机制仍有待进一步研究。本研究拟通过对颗粒细胞中表达异常的miRNAs在颗粒细胞中生物学功能的研究,进一步阐明PCOS的发病机制,并为PCOS的诊断和治疗提供理论基础。方法1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证从2015年11月至2018年2月在郑州大学第二附属医院生殖中心收集46名PCOS患者和32名健康女性的卵泡液,提取卵泡液中颗粒细胞。应用RT-qPCR检测颗粒细胞中 6 种候选 miRNAs(miR-33b,miR-34c,miR-106,miR-142,miR-193和miR-423)的表达差异。应用在线靶点预测软件预测PCOS组中异常表达miRNAs的作用靶点,然后构建靶基因报告质粒,并通过荧光素酶分析和蛋白免疫印迹进一步验证已预测靶点。我们通过ELISA检测PCOS患者和健康对照组颗粒细胞培养液中TGF-β1的表达,并利用RT-qPCR检测TGF-β1对颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423以及TGFBR1和SMAD7表达的影响。通过蛋白免疫印迹检测差异表达的miRNAs混合物对TGF-β信号通路相关蛋白(TGFBR1、SMAD2,SMAD3 和 SMAD7,CDKN1A 和 CDKN2B)表达的影响。最后,为了进一步了解PCOS患者的病理生理学,使用免疫印迹检测了 PCOS患者和健康对照的颗粒细胞中SMAD7和TGFBR1的蛋白质水平。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究用 miR-142 mimics、miR-33b mimics 和 miR-423 inhibitor 混合物转染人原代颗粒细胞48h,再用TGF-β1处理48h,然后用MTT检测细胞活力、Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡、流式细胞术检测细胞周期。结果1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证PCOS组患者的GCs中miR-142和miR-33b表达上调(p<0.05),而miR-423表达下调(p<0.05),其余三种miRNAs的表达在两组间没有显著差异。靶基因软件预测这三种miRNAs均和TGF-β信号通路相关,miR-142和miR-33b靶点是TGFBR1,miR-423靶点是SMAD7,并经双荧光素酶报告基因检测和蛋白免疫印迹验证。和健康对照相比,PCOS组GCs中TGF-β1的表达显著降低。TGF-β1能够显著降低miR-142和miR-33b的表达水平,升高miR-423的表达水平,且具有时间和剂量依赖性。另外,TGF-β1处理颗粒细胞后TGFBR1的表达水平显著升高,而SMAD7的表达水平显著降低。用miRNAs混合物处理的原代GCs中TGFBR1的水平降低,SMAD7水平升高。当用TGF-β1处理时,miRNAs混合物处理的细胞中p-SMAD2和p-SMAD3的水平较低。用miRNAs混合物处理的细胞中CDKN1A和CDKN2B mRNA的表达水平显著降低(p<0.01),而c-Myc的表达水平显著升高(p<0.01)。与对照相比,PCOS患者的颗粒细胞中SMAD7蛋白水平升高,而TGFBR1蛋白水平降低。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究miR-142 mimic,miR-33b mimic 和 miR-423 inhibitor 混合物组的相对细胞活力显著高于转染错配对照组(Scramble control)的细胞活力(p<0.01);混合物组的细胞凋亡率显著低于转染错配对照组(p<0.05);混合物组的G0/G1期细胞显著减少(p<0.05),S期细胞显著增加(p<0.01),而处于G2/M期细胞百分比在两组间无显著差异。结论1.PCOS颗粒细胞中异常表达miRNAs的检测及靶点预测验证与对照组相比PCOS患者的GCs中miR-142和miR-33b表达上调,而miR-423表达下调。三种miRNAs的靶点均涉及TGF-β信号通路:miR-142和miR-33b的靶点是TGFBR1;miR-423的靶点是SMAD7。PCOS患者颗粒细胞中TGF-β1表达显著降低,且TGF-β1对miR-142、miR-33b和miR-423具有负反馈调节的作用。miR-142 mimics、miR-33b mimics 和 miR-423 inhibitor 能够阻断颗粒细胞中TGF-β信号通路。PCOS患者颗粒细胞中SMAD7蛋白增加,TGFBR1蛋白减少。2.颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423生物学功能的研究miR-142 mimic,miR-33b mimic 和 miR-423 inhibitor 具有促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡的能力。全文结论:1.PCOS患者颗粒细胞中miR-142、miR-33b和miR-423表达异常。2.PCOS患者颗粒细胞异常表达的miRNAs通过靶向调节TGFBR1和SMAD7影响颗粒细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能,可能参与PCOS的发生。