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第一部分miR-101的双向负反馈环路目的：研究肝癌细胞中miR-101与EZH2之间的相互调控作用。方法：通过基因功能获得与失活策略,研究miR-101与EZH2在mRNA及蛋白水平上的相互关系。利用miRNA前体诱导实验,证实]miR-101/EZH2调控环路的效用并确定miR-101/EZH2调控环路的参与者。利用定量基因组PCR,研究miR-101缺失与miR-101前体诱导效率之间的关系。利用集落形成实验,迁移/侵袭实验、划痕实验评价升高miR-101后对肝癌细胞迁移及增殖能力的抑制作用。结果：升高miR-101可以降低EZH2的表达水平,而EZH2的表达升高可以抑制miR-101的表达。miR-101前体诱导实验发现,成熟miR-101只能诱导pre-mir-101-1的表达而对pre-mir-101-2的诱导作用不明显。HepG2与SMMC-7721细胞中, miR-101前体诱导效率的不同,与细胞中miR-101位点缺失程度有关。升高miR-101可以明显抑制肝癌细胞迁移及增殖能力。结论：在肝癌细胞中,miR-101与EZH2是以双向负反馈环路的形式进行相互调控的。干预这一环路对肝癌有抑制作用。第二部分利用双向电泳检测miRNA调控靶点的技术建构目的：构建可用于miRNA靶点发现的双向电泳体系。方法：利用慢病毒过表达载体,构建稳定表达miR-101的肝癌细胞系。通过双向电泳技术,分析过表达miR-101细胞系与空载体细胞系蛋白质谱的变化,从而实现miR-101调控靶点的鉴定。结果：利用24cm pH3-10非线性固相pH梯度干胶条,在10%的PAGE胶上可以分离到600个左右的蛋白质点,组内重复性较好,蛋白点匹配率达到99%以上。组间差异较大的蛋白质点20个左右。结论：利用双向电泳技术,可以同时发现诸多microRNA调控靶点。这为microRNA调控网络的研究提供了一个新的思路。第三部分miR-101调控靶点的质谱鉴定与分析目的：利用高效色谱串联质谱技术鉴定miR-101的下游调控靶点。方法：手工切取15个差异明显的蛋白质点,进行色谱分离与进行质谱鉴定。利用生物信息学技术,分析差异蛋白间的联系与功能。结果：15个差异点全部鉴定成功。差异蛋白有着明显的富集趋势。第一群,RNA结合蛋白；第二群,miR-200家族的相关靶蛋白；第三群,miR-101的相关靶蛋白。结论：质谱鉴定结果显示,上调miR-101对肝癌细胞的蛋白谱产生了广泛影响。下游调控点之间有着密切的联系。