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PEG化脂质体（PEGylated liposomes,PEG-L）在体内重复注射出现“加速血液清除”现象（Accelerated blood clearance phenomenon,ABC phenomenon）,使间隔几天向同一动物体内重复注射的脂质体在血液中消除速度加快,长循环特性丧失,并在肝脾组织中蓄积量增加。阐明ABC现象产生的机理为PEG-L的开发和临床转化提供理论依据。细胞色素P450酶（Cytochrome P450,P450）是参与药物代谢的重要酶系,P450s酶活性的高低决定了药物的代谢速率和清除率,而P450s本身又可被药物诱导或抑制,导致与其联用的其他药物或者自身代谢的改变。因此,PEG-L也可能会影响机体P450s的表达和活性,从而改变再次进入体内的PEG-L的分布和代谢行为。基于此,本课题探讨了P450s表达和活性的改变与ABC现象的关系,目前未见相关报道。本课题以临床常用的抗肿瘤药多西紫杉醇（Docetaxel,DTX）为模型药物,该药物主要经大鼠CYP3A1（人CYP3A4）代谢。采用生物相容性好且无毒的PEG2000-DSPE进行表面修饰,制备了PEG化多西紫杉醇脂质体（PEGylated liposomal docetaxel,PEG-DTX-L）,在观察到该脂质体诱导大鼠产生了ABC现象的基础上,利用鸡尾酒（cocktail）探针药物法考察了单次注射与重复两次注射PEG-L时各探针底物对应的P450s酶活性的差异,并同时检测了大鼠肝P450s基因和蛋白表达的差异;以P450s酶的特异性抑制剂为工具,明确P450s在PEG-L诱导的ABC现象中的作用;并通过检测单次注射与重复两次注射PEG-L时P450s上游的核受体（Nuclear receptor,NR）孕甾烷X受体（Pregnane X receptor,PXR）和组成型雄甾烷受体（Constitutive androstane receptor,CAR）在肝组织中的表达和核定位变化,观察PXR和CAR在ABC现象诱导过程中是否发生了核转位;并利用NRs的特异性激动剂为工具,进一步探讨PXR/CAR-P450s信号通路在ABC现象中相关的生物学机制,为寻求抑制和减弱ABC现象的方案提供科学依据,也为阐明ABC现象的发生机理给予进一步解释。目的:本课题着眼于从P450s酶活性改变的角度考察ABC现象的发生机理。首先,明确单次注射和重复两次注射PEG-L时P450s酶的活性是否改变,进而考察该酶活性的差异是否参与了ABC现象的诱导过程;探索PEG-L是否可能通过影响机体的PXR和/或CAR调控其下游靶基因P450s酶的转录和表达,从而改变再次进入体内的PEG-L的分布和代谢行为,以期揭示PXR/CAR-P450s信号通路在ABC现象中相关的生物学机制。方法:首先,根据单因素考察和正交试验确定模型脂质体PEG-DTX-L的最佳制备工艺和处方,并对PEG-DTX-L进行质量评价,同时采用激光粒度仪测量脂质体的粒径、多分散系数（Polydispersion index,PDI）和zeta电位;利用差示扫描量热法（Differential scanningcalorimeter,DSC）考察了药物在脂质体中的分散状态,并考察了脂质体的存储稳定性和体外释药性能。其次,运用高液相色谱-质谱联用（High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）技术分析大鼠血浆和肝脾组织样品中的DTX浓度,结合PEG-DTX-L在大鼠体内的药动学参数和肝脾组织分布特征,考察两次给药后PEG-DTX-L的血药浓度和肝脾蓄积浓度,从首次注射时载药与否、PEG2000-DSPE在首次注射中的含量、两次注射间隔的时间三个方面分析ABC现象强度是否受影响。接着,以雄性SD大鼠为研究对象,通过HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中cocktail探针底物的血药浓度及主要药动学参数,包括药时曲线下面积（Area under the concentration-time curve,AUC）、平均滞留时间（Mean residence time,MRT）、总清除率（Plasma clearance,CLz）和血浆半衰期(Plasma half-life,t1/2)等来评价单次注射与两次注射PEG-L时P450s酶活性的差异;并通过检测不同间隔时间重复给药后大鼠肝组织中P450s基因和蛋白水平,来探究P450s的活性和表达水平在ABC现象中的变化特点;然后,在重复两次注射PEG-L前预先给予P450s的特异性抑制剂,通过考察此时ABC现象强度是否减弱,明确P450s在ABC现象诱导过程中的作用。最后,通过检测P450s上游的核转录因子NRs在单次注射与重复两次注射PEG-L后的肝组织中表达和核定位变化,观察NRs在ABC现象诱导过程中的变化特点;并利用NRs的特异性激动剂为工具,考察大鼠PXR被诱导后对随后注射的PEG-DTX-L的药动学行为和肝P450s表达的影响,并与两次注射PEG-L诱导的ABC现象组相比较。结果:1.PEG-DTX-L的质量评价和表征通过注入法制备的PEG-DTX-L的平均粒径（约为118 nm）良好且分布的范围较窄（PDI值<0.2）,包封率（Entrapment efficiency,EE%）达到96.62%,zeta电位（绝对值>32 mV）符合脂质体要求,体系较稳定;并且通过TEM、DSC晶型结构分析、存储稳定性以及体外释药性能的研究发现,该脂质体质量符合药典要求。2.PEG-L重复给药诱导ABC现象强度的主要影响因素2.1 PEG-L首次注射时载药与否以及PEG2000-DSPE在首次注射时的含量对ABC现象强度的影响本实验以对照组与各试验组AUC和t1/2参数的比值(AUCC/T和t1/2-C/T)作为ABC现象强度的主要指标。与对照组相比,未载药的PEG2000-DSPE修饰的空白脂质体（PEG-B-L）与载药的PEG-DTX-L作为首次给药均导致CLz显著增加,同时AUC和t1/2明显减少,即二者均可诱导ABC现象的发生,并且二者的药动学特征相似。提示,DTX药物本身对ABC现象的强度影响不明显。此外,首剂量中PEG2000-DSPE的含量在0.0250.05μmoL/kg范围内对ABC现象强度的影响无明显差异。2.2 PEG-L两次注射间隔的时间对ABC现象强度的影响PEG-L两次给药间隔1 d7 d均诱导了ABC现象的发生,并且3 d组的ABC现象最明显,从3 d组开始随着间隔时间的延长ABC现象强度逐渐减弱,即7 d组ABC现象强度较3d和5 d组弱。然而,DTX在肝脾组织中的蓄积浓度完全不同。ABC现象强度最明显的3 d组大鼠的肝组织中DTX相对浓度最低,相反,3 d组大鼠脾组织中DTX相对浓度较对照组及其他试验组高。当延长两次注射的间隔时间后,肝组织蓄积浓度逐渐增加而脾组织浓度逐渐减少。3.单次和两次注射PEG-L对P450s活性和表达的诱导间隔3 d两次给药组与单次给药对照组对CYP3A1的探针底物咪达唑仑、CYP2C6的探针双氯芬酸钠和CYP1A2的探针非那西丁药动学的影响差异明显。与单次给药组相比,咪达唑仑在两次给药组中的CLz值明显增加（P<0.01）,AUC0-t和AUC0-∞显著减小（P<0.01）,t1/2较单次给药组明显缩短（P<0.05）。双氯芬酸钠在两次给药组中的CLz值与单次给药组相比明显增加（P<0.01）,AUC0-t和AUC0-∞显著减小（P<0.01）,t1/2、MRT0-t、MRT0-∞较单次给药组明显缩短（P<0.01）。非那西丁在两次给药组中的CLz值与PEG-L单次给药组相比明显增加（P<0.01）,AUC0-t和AUC0-∞显著减小（P<0.01）,同时t1/2较单次给药组减少,但未达到统计学意义。同时,PEG-L重复给药组的CYP3A1、CYP2C6和CYP1A2 mRNA和蛋白表达水平明显高于单次给药对照组。值得注意的是,CYP3A1、CYP2C6和CYP1A2三种酶基因和蛋白表达的增加开始于1 d组,在3 d组达到最大值,并随着间隔时间的延长而逐渐下降。4.P450s酶抑制剂对ABC现象强度的影响与未给酶抑制剂的ABC现象组相比,事先给予CYP3A1酶抑制剂的PEG-L两次给药组的t1/2-C/T减少了1.88倍,而AUCC/T并没有明显下降。与对照组相比,两次给药组的肝组织中的DTX蓄积浓度明显减少,事先给予CYP3A1酶抑制剂可明显上调减少的肝组织中DTX的蓄积浓度（P<0.01）。然而,CYP2C6酶抑制剂组的AUCC/T、t1/2-C/T值和肝脾组织中DTX的蓄积浓度较未给抑制剂对照组均无明显差异。5.PXR/CAR的激活及其下游靶基CYP3A1在ABC现象诱导过程中的作用与单次注射相比,CYP3A1上游的核转录因子PXR在重复注射PEG-L的大鼠肝组织中发生了明显的核转位,大鼠预先腹腔注射PXR的特异性诱导剂地塞米松（Dexamethasone,DEX）后,PEG-DTX-L的药动学行为与两次注射诱导的ABC现象组相似。并且,两组大鼠的肝CYP3A1 mRNA和蛋白表达较对照组均明显增加。不同于PXR的是,重复给药组的肝组织胞浆中CAR蛋白较对照组有所增加,但是胞核中的CAR蛋白没有明显增加,即没有发生核转位行为。并且重复给药组的大鼠肝维甲酸X受体α（Retinoid X receptorα,RXRα）蛋白在胞浆中的表达较对照组减少,而在胞核中的表达明显增加;免疫荧光共定位染色也发现相似的结果,即肝PXR-RXRα在胞核中发生了明显的共定位,而CAR没有。结论:1.由于本课题所用模型药物DTX主要是经过CYP3A1代谢,当CYP3A1的活性被抑制后,PEG-DTX-L在血液和肝组织中的代谢速度减慢,从而减轻了ABC现象的强度。提示,大鼠体内P450s表达和活性的增强是ABC现象发生的原因之一。2.重复注射PEG-L激活了PXR,PXR能上调CYP3A1基因的转录和表达,而CYP3A1同时也是代谢PEG-L所载药物DTX的主要代谢酶（即PEG-L既是CYP3A1的底物,也是CYP3A1的激活剂）,当短时间内向体内再次注射PEG-DTX-L后,CYP3A1的高活性可使PEG-DTX-L迅速代谢清除,而失去该脂质体应有的长循环特征。因此,PXR-CYP3A1信号通路的激活可能参与了ABC现象的发生。