研究背景与目的脓毒症(sepsis)是病原体(pathogen,PA)感染机体后,因PA所释放的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)被体内的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别所引发的失控性炎症反应综合症;在PAMPs中,存在于革兰阴性细菌外膜的脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是至今研究最为深入的一种PAMP,是诱发脓毒症的重要PAMP。因此研究针对LPS的拮抗和清除机制,对脓毒症的预防和治疗具有重要意义。苦柯胺B(Kukoamine B,KB)是我们课题组在前期研究中从传统中药地骨皮中发现、分离并已实现全化学合成的一种生物碱类化合物,KB在体内外具有中和LPS的致炎生物学效应,可显著提高脓毒症模型动物的生存率,该化合物现已完成Ⅰ期临床试验。KB拮抗脓毒症的作用机制在于与LPS具有高亲和力的结合作用,这种结合作用使其与LPS结合并形成KB/LPS复合物后,从而阻断了LPS的致炎生物学效应,但所形成的KB/LPS复合物在体内是如何分布、代谢以及有无蓄积的可能性等等均不清楚。因此探索KB/LPS复合物在体内的分布、代谢,对深入阐明KB的作用机制和安全性具有重要意义。为解决上述问题,本课题拟以荧光素分别标记LPS、KB以及研究中涉及的细胞和受体等,并应用激光共聚焦(laser scanning confocal microscopy,LSCM)、流式细胞术(flow cytometry,FCM)、siRNA干扰等技术探索KB/LPS复合物在体内的分布及代谢的分子机制。方法:1.KB/LPS复合物形成后对LPS在体内分布影响的研究以FITC标记LPS(FITC-LPS)对KB/LPS复合物进行示踪,取FITC-LPS(1mg/kg)与KB(3.6mg/kg)体外混匀,37℃,振荡30min制备KB/FITC-LPS复合物,将LPS或KB/LPS复合物经尾静脉注射C57 BL/6小鼠体内,分别于注射后1、4、8和24 h采集外周血,分离血浆并检测FITC-LPS的荧光强度,明确KB对外周血LPS水平的影响;在相同时相点获取心、肝、脾、肺、肾等脏器并进行组织匀浆,检测匀浆液中FITC-LPS的荧光强度,明确游离LPS或KB/LPS复合物在小鼠各脏器的分布情况。2.肝脏参与摄取KB/LPS复合物主要细胞类型的研究2.1 C57 BL/6小鼠尾静脉注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS复合物1h后,获取小鼠肝脏制备组织冰冻切片;分别以Cy3-cytokeration 18、Cy3-F4/80、Cy3-CD31、Cy3-GFAP抗体标记肝细胞(Hepatocytes,HC)、枯否细胞(Kupffer cell,KC)、肝窦内皮细胞(Liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)、肝星形细胞(Hepatic stellate cells,HSC),利用LSCM检测肝脏主要细胞与FITC-LPS的共定位情况,确认肝脏参与LPS摄取和代谢的主要细胞类型。2.2尾静脉注射Clophosome.A.Clodronate liposomes制作KC耗损的小鼠模型,48 h后,获取肝组织制作冰冻切片,以Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration 18抗体分别标记KC或HC,利用LSCM技术观察KC的耗损情况。KC耗损小鼠或C57BL/6小鼠经尾静脉注射KB/FITC-LPS复合物,1h后获取肝组织制作冰冻切片,以Cy3-F4/80或Cy3-cytokeration 18抗体分别标记KC或HC,LSCM检测肝组织冰冻切片中FITC-LPS的平均荧光强度以及与KC和HC的共定位情况,明确KC是否参与介导肝脏对KB/FITC-LPS复合物的摄取。2.3采用肝原位灌洗,密度梯度离心并结合免疫磁珠分离,获取C57 BL/6小鼠原代HC和KC,以人肝肿瘤细胞(Hep G2)或小鼠吞噬细胞(RAW264.7)作为对照细胞株;将上述细胞分别以FITC-LPS或KB/FITC-LPS复合物处理1h,FCM检测FITC-LPS的摄取,比较分析HC或KC摄取游离LPS和KB/LPS复合物的差异。3.HC参与摄取KB/LPS复合物受体类型的研究3.1实时荧光定量PCR检测KB对HC中内吞相关受体m RNA表达的影响获取C57 BL/6小鼠原代HC,用LPS(1μg/ml)或KB(15μM)或KB/LPS复合物处理HC 4h,RT-PCR检测ASGPR、SR-B1、SR-A、TRFC、MARCO、LOX-1和TLR4的m RNA水平,分析HC中可能参与KB或KB/LPS复合物摄取的受体类型。3.2采用蛋白质印迹(Western blot,WB)、FCM等分析ASGPR受体与HC摄取KB/LPS复合物的关系(1)获取C57 BL/6小鼠原代HC,KB(15μM)处理1、2、和4 h,WB检测HC的ASGPR受体的蛋白表达水平,并与同时相点未处理HC进行比较,分析KB对HC的ASGPR受体表达的影响。(2)C57 BL/6小鼠尾静脉注射KB(3.6mg/kg),分别于1、2和4h取材,WB检测肝脏组织ASGPR受体的蛋白表达水平,并与同时相点未处理小鼠进行比较,分析KB对小鼠肝组织的ASGPR受体表达的影响。(3)利用siRNA转染下调Hep G2的ASGPR受体表达,KB/FITC-LPS复合物处理ASGPR受体下调后的Hep G2细胞1h,FCM检测Hep G2摄取FITC-LPS的荧光强度,分析ASGPR受体表达下调对HC摄取KB/LPS复合物的影响,确认ASGPR受体是否参与HC对KB/LPS复合物的摄取。3.3 LSCM检测KB与ASGPR受体的空间共定位情况,并结合竞争性摄取实验、分子模拟对接,以确认识别并结合KB是否是ASGPR受体介导KB/LPS复合物摄取的具体方式。(1)获取C57BL/6小鼠原代HC,FITC-KB(15μM)处理HC 30min,Cy3-ASGPR标记ASGPR受体,LSCM检测,分析KB与ASGPR受体是否存在空间共定位。(2)获取C57BL/6小鼠原代HC,FITC-KB(15μM)单独或与Ga LNAc(0.25、0.5和1.0m M)共同处理细胞1h,LSCM检测,HC摄取FITC-KB的变化,确认Ga LNAc与KB是否存在竞争被HC摄取的效应。(3)利用分子对接软件Auto Dock Vina对KB与ASGPR受体H1亚基的结合位点及结合力进行模拟;利用Auto Dock Tools GUI在H1亚基的大小为20×18×20埃的空间,以6.46×-4.47×10.41点为中心,且包含碳水化化物识别区域为构象研究对象,分析比对KB与其可能结合位点及结合力,并通过软件Auto Dock Tools和Lig Plot+,对计算结果进行分析。4.HC降解和清除KB/LPS复合物的分子机制研究获取TLR4-/-小鼠原代HC,分别以FITC-LPS或FITC-KB对KB/LPS复合物进行示踪,用KB/LPS复合物处理HC 1h后,分别对HC内的早期内体(Cy3-EEA1抗体)或晚期内体(Cy3-Rab7抗体)或溶酶体(Cy3-LAMP1抗体)及ASGPR受体(Alexa Fluor647-ASGPR抗体)进行标记,LSCM检测分析KB/LPS复合物是否与ASGPR受体及内体或溶酶体存在空间共定位,确认KB/LPS复合物在HC内被降解和清除的可能途径。结果:1.KB/LPS复合物形成后对LPS在体内分布影响的研究血浆检测结果显示,注射FITC-LPS或KB/FITC-LPS复合物后1、4、8和24h,KB+LPS组较LPS组FITC-LPS检测值显著下降(P<0.01),结果表明KB/LPS复合物的形成加快了外周血LPS的清除;脏器组织匀浆检测结果显示,在1、4、8和24h,LPS主要分布在肝脏,而心、脾、肺、肾等较少,结果表明肝脏是参与LPS代谢的主要器官;KB+LPS组较LPS组肝组织内FITC-LPS值显著增加(P<0.05);提示,KB/LPS复合物的形成促进了LPS在肝脏的富集。2.肝脏参与摄取KB/LPS复合物主要细胞类型的研究2.1 LSCM检测结果表明,肝组织切片中LPS主要分布于HC和KC细胞中,而HSC和LSEC未见明显的LPS摄取,提示,HC和KC是肝脏参与摄取LPS的主要细胞类型。2.2小鼠经尾静脉注射Clophosome.A.Clodronate liposomes后,可见肝组织切片(Cy3-F4/80)阳性细胞(KC)数明显减少,而(Cy3-cytokeration 18)阳性细胞(HC)数无明显变化,表明KC耗损;在KC耗损组和未外理组小鼠中,KB/FITC-LPS复合物均可被肝组织摄取,提示,KC耗损与否不影响肝脏摄取KB/LPS复合物,KC可能不是参与摄取KB/LPS复合物的主要细胞。2.3 FCM检测结果表明,与LPS组进行比较,KB/LPS复合物形成可显著促进C57BL/6小鼠HC、Hep G2摄取LPS(P<0.05),同时也可显著抑制了C57 BL/6小鼠KC、RAW264.7摄取LPS(P<0.05),提示,结合型LPS主要依赖HC摄取,游离型LPS主要依赖KC摄取,KB/LPS复合物在肝脏主要被HC摄取。3.HC参与摄取KB/LPS复合物受体类型的研究3.1 RT-PCR检测结果表明,与未处理组比较,KB或KB/LPS复合物均可显著上调HC的ASGPR受体的m RNA水平(P<0.05,P<0.01)。3.2 Western blot结果表明,未经KB处理的HC,在体外培养1、2和4h后,ASGPR受体的表达随时间的延长逐渐减弱;KB处理组HC在1和2 h ASGPR受体蛋白表达水平随时间延长逐步增加,而4 h则显著减少。KB注射小鼠肝组织,在1、2和4h,随时间的延长,ASGPR受体蛋白痕迹带颜色逐渐加深,而未处理组小鼠,呈逐渐减弱趋势,结果表明,KB被HC或肝脏摄取可显著上调ASGPR受体蛋白表达水平。FCM检测,相对荧光强度结果表明,Hep G2的ASGPR受体蛋白表达下调可显著抑制了Hep G2摄取LPS(P<0.05,vs NC-siRNA处理组),提示,ASGPR受体参与了HC摄取KB/LPS复合物。3.3 LSCM检测图像显示,KB(绿色)与HC膜上的ASGPR受体(红色)在HC细胞膜上显示两者重合,结果表明KB与ASGPR受体存在空间共定位,提示,KB可与ASGPR受体结合。LSCM检测图像显示,随着Ga LNAc加入量增加,HC内摄取的FITC-KB(绿色)荧光物质逐渐减少,FITC-KB的平均荧光强度结果表明,Ga LNAc会显著抑制HC对KB的摄取(P<0.01),提示,Ga LNAc与KB在HC膜上存在共同的介导内化途径。分子对接结果显示,KB与ASGPR受体的Asp241、Gln239、Glu252、Asn264、Asn208等氨基酸残基存在氢键结合,此外,KB还与ASGPR受体的Tyr272、Asp266、Arg270、Trp243、Asn264、Arg236、Thr258等残基存在疏水作用,提示,KB与ASGPR受体存在结合作用。4.HC降解和清除KB/LPS复合物的降解清除途径研究。LSCM检测图像显示,KB/LPS复合物内化入HC后,均显示,FITC-KB(绿色)或FITC-LPS(绿色)在Cy3标记EEA1(红色)或Cy3标记Rab7(红色)或Cy3标记LAMP1(红色)中存在,并与647-ASGPR(黄色)重合,表明,三者存在空间共定位现象;提示,KB/LPS复合物经ASGPR受体内化入HC后可能由ASGPR受体相关内体-溶酶体途径被降解和清除。结论:1.KB与LPS形成KB/LPS复合物后加快了小鼠外周血中LPS的清除,该现象与KB促进LPS在肝脏的富集密切相关。2.KB/LPS复合物在肝脏主要被HC摄取,HC对KB/LPS复合物的摄取依赖膜受体ASGPR对KB的识别而介导其内化。3.KB/LPS复合物经HC膜受体ASGPR介导内化后,可能由ASGPR受体相关的内体-溶酶体途径被降解、清除。