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目的:大肠埃希菌是机体正常肠道菌群之一,属于条件致病菌,主要引起肠道内感染一腹泻;肠道外感染一多为内源性感染,以尿路感染(urinary tract infection,UTI)最为常见,还有胆囊炎、新生儿脑膜炎、腹膜炎、败血症等。引起尿路感染的大肠杆菌,以部分血清群为主,大部分是属于O血清型,称之为尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic escherichia coli,UPEC)。尿路感染是临床上最常见的感染性疾病之一,尤其多见于女性,其次是老年人及儿童,并且复发率高。革兰阴性及阳性菌均可导致UTI,但是尿路致病性大肠杆菌占了其中的80-90%[1]。UPEC的感染路线是非常明确的:UPEC与共生的大肠杆菌共同定居于肠道——在毒力岛编码的各种活性因子的作用下移行至尿道-膀胱-沿输尿管上行进入肾脏,大多数感染发生在下尿路的膀胱(膀胱炎),但是也会发生上尿路感染。UPEC拥有许多不同的毒力因子,包括Afa/Dr粘附素、Ⅰ型菌毛、细胞毒性坏死因子1、α-溶血素、脂多糖等,这些毒力因子在一定程度上促进了UPEC粘附、侵袭宿主细胞。其中UPEC对尿路上皮细胞的粘附能力是其致病的先决条件,其有助于UPEC附着于尿路上皮避免被尿液冲刷清除[2-3]。近几年来,发现有些表面上看来是胞外菌的病原体被证明是胞内条件性致病菌,作为UTI的主要病原菌,UPEC也位列其中[4]。UPEC能够侵入宿主细胞以及尿道上皮组织,并在其中生存繁殖,这有助于其在宿主体内有效扩散。另外UPEC是生物膜感染的常见病原菌,细菌感染形成生物膜后,可以发挥协同作用,形成复杂有序的立体结构,逃避免疫系统攻击,具有较高程度的耐药性,并可在生物膜解离后播散,导致其他系统的感染[5]。UPEC导致的尿路感染有强烈的复发倾向,通常发生在初次急性感染后的几周或几个月期间,尿路感染的反复发作会导致瘢痕肾,还可增加发生膀胱癌的风险,加之UPEC对多种抗生素的耐药性,给治疗带来极大的困难,尿路感染的治疗已成为临床亟待解决的难题。揭示新的毒力因子及其在尿路感染过程中的作用是现在的首要任务。聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase1,PPK1)是某些细菌体内负责催化ATP脱磷酸残基形成聚磷酸盐(polyphosphate,poly P)的一种主要激酶,其主要负责聚磷酸盐的合成与ATP的代谢[6]。某些ppk1基因缺失的病原菌,其poly P合成量明显减少,而且存在毒力缺陷,如生物膜形成、捕食能力、对外界不利条件的抵抗力、运动性等均有减弱[7-8]。那么尿路致病性大肠杆菌的ppk1基因缺失,是否会对其致病性产生影响,目前并不清楚,而这也正是本文所要探求的问题。UPEC分离株 CFT073基因组测序已完成,这为我们构建基因缺失株,进一步研究其致病的分子机制提供了可能性。 方法:以尿路致病性大肠杆菌(CFT073)为研究对象,利用 Red同源重组技术敲除CFT073的ppk1基因,构建缺失株△pk1;根据革兰染色及镜检观察野生株和缺失株的形态,比较野生株、缺失株的菌落形成能力,并分别绘制出野生株、缺失株的生长曲线;以人膀胱癌上皮细胞5637为体外模型,根据菌落数计算细菌的黏附率和侵袭率,比较野生株、缺失株的粘附与侵袭力;体外比较野生株、缺失株在高热、高渗透压及酸性环境压力条件下,两者的生存率变化;采用96孔板结晶紫染色法分析CFT073 ppk1基因的缺失对其生物膜形成能力的影响。 结果:⑴以pET28a载体为模板,利用含有同源重组臂的引物通过PCR扩增技术成功构建具有卡那抗性1602bp大小的ppk1基因打靶片段。利用卡那霉素抗性挑选出10个克隆子进行正向筛选和反向验证。正向筛选结果显示第1、2号克隆的PCR片段变小,与预期结果一致(1978bp)。判断这两个克隆为ppk1基因缺失的菌株。第1,2号克隆的反向验证扩增无1254bp长度的PCR片段,与预期结果一致,这说明第1、2号克隆在PCR水平被验证了ppk1基因已经缺失。最后选取第1号克隆的正向筛选PCR产物,用两侧扩增引物进行测序。经序列测序验证可知第1号克隆为ppk1基因缺失菌株,因为第1号克隆基因组上ppk1基因ORF区域按设计已完全被卡那抗性基因序列替代,而且CFT073本身的基因组序列在测序范围内未发生任何突变,说明成功构建了CFT073 ppk1缺失株△pk1。⑵革兰染色显微镜观察,野生株和缺失株均为革兰氏阴性短杆菌,并无差别。两菌株在LB固体平板培养基上的菌落大小相近,形态均为乳白色、湿润、表面光滑的圆形菌落,菌落边缘整齐,且表面和背面一致。根据所测得的OD600值所绘制的生长曲线,可知野生株和缺失株在营养丰富的LB液体培养基中生长曲线基本一致,这说明ppk1基因的缺失并不影响菌株营养丰富时的生长。但是ppk1基因敲除株△pk1在低营养的MOPS培养液中的生长能力较野生株明显减弱。⑶经吉姆萨染色后镜下观察比较两者的粘附菌数,实验结果表明△pk1对5637细胞的粘附能力较CFT073显著减弱,提示ppk1可影响UPEC对宿主细胞的粘附能力。根据公式计算出菌株对膀胱癌上皮细胞5637的侵袭率,利用SPSS13.0对所得数据采用单因素方差分析,缺失株侵袭率为(0.18±0.04)%,明显低于野生株侵袭率(0.48±0.09)%,且P<0.05,差异具有统计学意义。这说明ppk1基因的敲除明显减弱了尿路致病性大肠杆菌CFT073的侵袭能力。⑷比较ppk1缺失株和野生株在热刺激、高渗透压以及酸性培养条件下的生存率结果显示,ppk1基因敲除后在这些压力条件下的生存率均明显下降,这也表明ppk1在CFT073抵抗外界环境压力中具有重要作用。⑸用96孔板结晶紫染色法检测野生株与缺失株生物膜形成能力差异,结果显示两菌株在生物膜形成稳定之前随着培养时间的延长而增强,但缺失株在各时间段的生物膜形成能力均比野生株明显减弱。经两独立样本t检验分析,野生株与缺失株之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论:①利用Red同源重组技术可成功敲除CFT073的ppk1基因,从而成功构建ppk1基因缺失株△pk1。②ppk1基因对于 CFT073的形态和生长规律并无太大影响,ppk1缺失株的菌体和菌落形态以及在LB培养液中的生长能力与野生株一致,只是ppk1基因缺失株△pk1在低营养的MOPS培养液中的生长能力较野生株明显减弱。③ppk1与尿路致病性大肠杆菌CFT073的致病性有重要联系, ppk1的缺失可以使CFT073的粘附、侵袭尿路上皮及生物膜形成能力均减弱。