健脾益肺口服液对慢阻肺“肺脾气虚证”大鼠免疫功能及气道炎症的影响

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[目的]:   探明健脾益肺口服液对慢性阻塞性肺疾病稳定期大鼠免疫功能、气道炎症的影响,求证健脾益肺口服液是否通过NF-κB信号传导途径来调节慢阻肺大鼠免疫功能及抑制其气道炎症,为健脾益肺口服液临床治疗慢阻肺病人提供实验依据,从而进一步论证将“健脾益肺法”作为慢阻肺稳定期中医药治疗手段的可行性和重要性;深入理解“肺脾气虚”这一慢阻肺稳定期中医证型和客观指标“免疫功能低下”及“气道炎症指标”等的相关性,加深对慢阻肺稳定期肺脾气虚证本质的认识,促进中医证型客观化,对指导中医药治疗慢阻肺稳定期的基础研究具有重要意义。   [方法]:   1.理论探讨方面:对慢阻肺中医病机进行深入探讨;深入分析健脾益肺法治疗慢阻肺的依据;探析健脾益肺口服液的方义,分析其用于调节慢阻肺免疫功能、抑制气道炎症的可行性。   2.实验研究方面:将65只SD成年雄性大鼠随机分为6组,空白对照组10只、其余各组每组11只,分别为模型组、健脾益肺口服液高、中、低剂量组及地塞米松阳性药对照组;用香烟烟熏加脂多糖复合因素复制慢阻肺“肺气虚证”动物模型,然后用大黄煎液灌胃复制“脾气虚证”模型:造模28天结束,在14天开始按照实验设计给药,28天后测定指标;观察各组大鼠整体情况、HE染色后观察各组基本病理变化:MASSON染色后观察各组胶原含量、平滑肌厚度等;应用图像分析系统测定支气管平滑肌厚度、气管内径等,计算支气管平滑肌指数、胶原纤维面积;取动脉血,抗凝后用动脉血气分析仪测定大鼠PaCO2、PaO2、PH及SaO2等动脉血气指标;取血后剥离大鼠胸腺、脾脏,根据体质量计算大鼠胸腺指数、脾脏指数;麻醉后取血,抗凝后用流式细胞仪测定血液中CD3+、CD4+、CD8+的表达率,并计算CD4+/CD8+比值;部分血液离心后取血清,用ELISA试剂盒测定IgG、IgA、IgM水平及IL-8、TNF-α活性;取大鼠肺部组织,液氮速冻研磨用trizol提取组织mRNA,逆转录后,设计引物进行real-timePCR扩增,以内参为对照,观察各组肺组织IL-8、TNF-αmRNA的基因表达;肺部组织用试剂盒提取组织蛋白质,利用蛋白印迹(WB,Westernblotting)方法,测定各组肺组织NF-κB和I-κB的表达。   [结果]:   1.通过对动物模型的整体观察及肺组织病理学结果,证实了慢阻肺“肺脾气虚证”动物模型的复制是成功的,从而为实验的顺利进行提供了依据;   2.健脾益肺口服液能显著改善慢阻肺实验大鼠的整体情况,如咳嗽、体重、精神状态等;   3.健脾益肺口服液能显著抑制大鼠气道炎症,降低胶原含量、胶原纤维面积、支气管平滑肌指数,改善气道重塑,作用类似于或优于地塞米松,以高、中剂量组为佳;   4.健脾益肺口服液能改善大鼠缺氧状态,由此提高大鼠的存活率,改善生存质量,但对PCO2、PH无明显改善作用;   5.健脾益肺口服液能显著提高慢阻肺大鼠细胞及体液免疫功能,降低其急性发作次数;   6.健脾益肺口服液能抑制IL-8、TNF-α炎性标志物的浓度及IL-8、TNF-αmRNA在肺组织的表达,疗效以高、中剂量组为佳;   7.健脾益肺口服可增加慢阻肺大鼠体质量、胸腺指数、脾脏指数,提高机体免疫力,增强防病抗病能力;   8.健脾益肺口服液可降低NF-κB在肺组织的表达,提高了I-κB的表达。而NF-κB信号传导途径在慢阻肺气道炎症反应、免疫调节中起着重要作用,本实验健脾益肺口服液提高了免疫功能、抑制了气道炎症,同时下调NF-KB在肺组织的表达,上调I-κB的表达,故推测健脾益肺口服液可能通过NF-κB信号传导途径调节COPD免疫功能、抑制气道炎症。   [结论]:   1.肺脾气虚直接关系到慢阻肺的发生、发展,为慢阻肺稳定期的病机关键。从“肺脾气虚证”的病机出发,立法健脾益肺,通过健脾而达到补益肺气的目的。   2.健脾益肺口服液能增强慢阻肺实验大鼠免疫功能、抑制其气道炎症,改善气道重塑,且一般以高、中剂量组为佳,对部分指标的疗效呈剂量依赖性;其机制可能为通过NF-κB信号传导途径抑制慢阻肺大鼠气道炎症、调控其免疫功能;并有可能通过下调炎症因子调节慢阻肺免疫功能。   3.慢阻肺“肺脾气虚证”病证结合动物模型的成功复制使研究更有针对性,在中医基础研究与临床研究之间架起了桥梁,有助于中医药作用机制的研究,且对于深层次探讨中西医理论的内在联系有重要意义。   4.本研究加深了对慢阻肺稳定期“肺脾气虚证”本质的认识,在促进中医药疗效机制的阐明及中药新药的研发中具有重要意义,为探索出中医药治疗慢阻肺的优势环节、作用靶点提供了依据。
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