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背景:正己烷是一种有机溶剂,广泛应用于各种工业生产过程,如油漆、电子清洗、印刷和制鞋等。若使用不当,正己烷极易造成以感觉运动型周围神经损伤为主要临床特征的慢性中毒。2,5-己二酮(2,5-hexanedione,HD)是正己烷在体内的代谢产物,是介导正己烷中毒性周围神经病发生的终毒物。前期我们通过建立HD中毒大鼠模型,发现HD暴露可诱导神经炎症、刺激炎症因子释放,从而对神经元造成损伤,提示神经炎症反应可能在HD中毒性神经病中起到重要作用。但是HD诱导神经炎症反应的分子机制目前尚不清楚。炎症小体活化能够产生相应的成熟细胞因子,调节炎症反应,是近年来神经炎症领域的研究重点。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体能够识别多种类型的病原体及危险分子,是目前研究最多的炎症小体。NLRP3炎症小体活化引起半光氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)前体裂解成有活性的caspase-1,caspase-1一方面促进白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的产生,进而通过激活多种下游信号驱动炎症反应,导致神经元损伤;另一方面可以裂解Gasdermin D蛋白(GSDMD)形成N-末端GSDMD-N,GSDMD-N可以在细胞膜形成孔洞,导致细胞膨胀破裂,释放大量炎症因子,引发细胞焦亡,造成神经损伤。研究表明NLRP3炎症小体在阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等神经退行性疾病的发展中起重要作用。但是,NLRP3炎症小体是否在HD诱导的神经炎症和神经系统损伤中起作用未见报道。目的:通过建立HD中毒性神经病大鼠模型,观察HD对大鼠坐骨神经组织中NLRP3炎症小体活化的影响,探讨HD引起神经炎症反应的分子机制。同时探讨NLRP3炎症小体抑制剂格列本脲(Glybenclamide,Gly)对HD中毒性神经病的保护作用,为HD中毒性神经病的分子机制和治疗研究提供理论依据。方法:1.HD中毒性神经病大鼠模型建立:选用45只SPF级雄性SD大鼠,体重为180-220g,适应性喂养7天后,按体重随机分为3组:对照组(Con)、200 mg/kg HD剂量组、400 mg/kg HD剂量组,每组15只。HD采用腹腔注射方式染毒,每周5天,每日1次,连续8周。Con组给予等剂量的0.9%的生理盐水。2.Gly保护模型:选用60只SPF级雄性SD大鼠,体重为180-220g,适应性喂养7天后,按体重随机分为4组:对照组(Con)、400 mg/kg HD组、400 mg/kg HD+Gly组和单独Gly组,每组15只。HD染毒方法同上。Gly(1 mg/kg)在HD染毒前30分钟通过腹腔注射到大鼠体内,每周5次,每日1次,连续8周。Con组和单独Gly组分别给予等剂量的0.9%生理盐水和Gly。3.Western blot检测:检测大鼠坐骨神经组织NLRP3炎症小体表达与活化水平;细胞焦亡蛋白GSDMD、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)和神经丝L(neurofilament protein,NF-L)蛋白表达水平;巨噬细胞标记物CD11b和Iba-1蛋白表达水平。4.免疫荧光检测:利用anti-Iba-1抗体进行免疫荧光染色检测HD对巨噬细胞浸润的影响;利用anti-caspase-1和anti-Iba-1抗体进行免疫荧光双染检测HD对大鼠坐骨神经组织巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的影响。5.电镜观察:利用透射电镜观察大鼠坐骨神经轴突的病理变化。6.q RT-PCR检测:检测坐骨神经组织巨噬细胞M1(i NOS、TNF-α)和M2(Arg-1、MRC-1)极化标记物的m RNA水平;NLRP3炎症小体(ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β)标记物的m RNA水平。7.酶联免疫吸附检测(ELISA)检测:采用ELISA试剂盒检测大鼠坐骨神经组织中IL-1β的含量。8.氧化应激检测:采用试剂盒检测大鼠坐骨神经组织丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和总抗氧化能力。结果:1.HD中毒大鼠模型建立及步态评分的变化:HD染毒后,200mg/kg HD组大鼠出现轻度步态异常,脚尖着地;400 mg/kg HD组大鼠出现典型的中毒性周围神经病特征,表现为逐渐出现步态不稳、后肢无力、拖地,最终无法站立直至瘫痪。步态评分结果显示,HD染毒后,大鼠步态评分随时间逐渐增加。染毒8周时,200mg/kg HD组大鼠步态评分平均为1.50±0.55,与Con组(1.00±0.00)相比差异无统计学意义;400 mg/kg HD组大鼠步态评分平均为4.00±0.00,与Con组(1.00±0.00)相比差异有统计学意义(P<0.01)。2.HD染毒对大鼠坐骨神经NLRP3炎症小体活化的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,200 mg/kg HD组大鼠坐骨神经NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表达水平无明显改变,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。q RT-PCR检测结果显示,与Con组相比,200 mg/kg HD组大鼠坐骨神经NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βm RNA含量无明显变化,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1βm RNA含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。ELISA结果显示,与Con组相比,200 mg/kg HD组大鼠坐骨神经IL-1β含量无明显变化,400 mg/kg HD组IL-1β含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。这些结果说明400 mg/kg HD能够诱导大鼠坐骨神经NLRP3炎症小体的活化。3.HD染毒对大鼠坐骨神经巨噬细胞浸润的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,200 mg/kg HD组大鼠坐骨神经巨噬细胞标记物Iba-1和CD11b蛋白表达水平无明显变化,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经Iba-1和CD11b蛋白表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,与Con组相比,400mg/kg HD组大鼠坐骨神经Iba-1~+巨噬细胞数量明显增加。这些结果说明400mg/kg HD能够诱导大鼠坐骨神经巨噬细胞浸润。4.HD染毒对大鼠坐骨神经巨噬细胞极化的影响:q RT-PCR结果显示,与Con组相比,200 mg/kg HD组大鼠坐骨神经M1和M2标记物m RNA水平无明显变化,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经M1极化标记物i NOS和TNF-α的m RNA水平明显升高,M2极化标记物Arg-1和MRC-1的m RNA水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。这些结果说明400 mg/kg HD能够诱导巨噬细胞M1极化。5.Gly对HD染毒大鼠坐骨神经NLRP3炎症小体活化的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表达水平明显增加;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β蛋白表达增加,与400 mg/kg HD组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果与Western blot结果一致,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经IL-1β含量明显增加;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经IL-1β含量增加,与400 mg/kg HD组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。6.Gly对HD染毒大鼠坐骨神经巨噬细胞浸润和极化的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经CD11b和Iba-1蛋白表达水平明显增加;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经CD11b和Iba-1蛋白表达增加,与400 mg/kg HD组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果与Western blot结果一致,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经Iba-1~+巨噬细胞数明显增加;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的Iba-1~+巨噬细胞浸润。q RT-PCR结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经M1标记物i NOS、TNF-α的m RNA水平明显增加,M2标记物Arg-1、MRC-1的m RNA水平减少;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经组织i NOS、TNF-α的m RNA水平增加和Arg-1、MRC-1的m RNA水平下降,与400 mg/kg HD组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.Gly对HD染毒大鼠坐骨神经氧化应激的影响:检测分析发现,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经MDA含量明显增加,GSH含量减少;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经MDA含量增加和GSH含量下降,与400 mg/kg HD组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。总抗氧化能力检测结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经总抗氧化能力减少;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经总抗氧化能力下降,与400 mg/kg HD组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.Gly对HD染毒大鼠坐骨神经毒性的影响:Western blot结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经GSDMD-N含量明显增加,NF-L和MBP蛋白含量明显减少;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经GSDMD-N含量增加和NF-L、MBP蛋白含量下降,与400 mg/kg HD组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光检测结果与Western blot结果一致,与Con组相比,400mg/kg HD组大鼠坐骨神经MBP表达明显降低;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经MBP蛋白表达下降,与400 mg/kg HD组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。电镜结果显示,与Con组相比,400 mg/kg HD组大鼠坐骨神经髓鞘结构改变明显,髓鞘显著变薄;Gly明显减轻400 mg/kg HD诱导的大鼠坐骨神经髓鞘损伤。9.Gly对HD染毒大鼠体重、步态的影响:与Con组相比,400mg/kg HD组大鼠出现体重明显减少和步态异常;Gly明显减轻400mg/kg HD诱导的大鼠体重下降和步态异常。体重检测结果显示,与400mg/kg HD组相比,400mg/kg HD+Gly组大鼠体重增加了13.7%,差异具有统计学意义(P<0.01)。步态评分结果显示,与400mg/kg HD组(4.00±0.00)相比,400mg/kg HD+Gly组大鼠步态评分降低为2.00±0.76,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.HD能够诱导大鼠坐骨神经NLRP3炎症小体活化。2.NLRP3炎症小体参与HD诱导的神经毒性可能与调控巨噬细胞浸润、巨噬细胞M1极化和氧化应激有关。3.NLRP3炎症小体抑制剂Gly可减轻HD诱导的神经毒性和运动功能障碍。