背景:肺癌是全球最常见的恶性肿瘤,是肿瘤相关死亡的最主要原因。由于肺癌细胞具有较强的侵袭能力,肺癌患者极易出现复发和转移,且一旦发生转移,患者的死亡率极高。因此,控制肿瘤转移仍是肺癌研究领域急需解决的主要问题。大量研究表明,肿瘤转移包括肿瘤细胞的游离、迁移、侵袭、适应和重新粘附等过程,这一系列过程与肿瘤细胞所处的微环境密切相关。肿瘤微环境主要是由三部分组成,分别为肿瘤细胞、间质细胞和细胞外基质。其中,间质细胞在肿瘤转移过程中发挥着重要作用。一方面,肿瘤细胞首先经过直接或间接方式对间质细胞进行改造,使其变成癌相关间质细胞;另一方面,改造后的间质细胞反过来促进肿瘤细胞的生长发展及转移。间质细胞中数量最多的细胞是成纤维细胞,它在肿瘤转移中发挥的巨大作用引起了很多的关注,但目前对癌相关成纤维细胞促进肺腺癌转移的研究尚处于起步阶段,其中一些相互作用过程未得到完全证实,其中一些深入的分子机制尚需要进一步挖掘。近年来,随着后基因组时代的来临,转录组学在癌症机理研究中已得到广泛应用。转录组学,是指一门在整体水平上研究特定条件下细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。转录组学研究的目的是对特定细胞中的基因定量分析和定性研究,对不同细胞间的基因差异表达、基因结构等进行研究,从而发现与疾病发生发展相关的基因、分子机理和调控网络等。目前,基于转录组学技术的癌相关成纤维细胞促进肺腺癌转移的分子机制研究相对较少。故本研究拟基于转录组学技术,研究癌相关成纤维细胞促进肺腺癌转移的分子机制,研究结果有望为发现潜在的EMT生物标志物和肺癌转移治疗靶点提供了可能,并进一步探讨转录组学技术在肺癌与微环境相关研究中的应用价值。研究方法:1.CAF诱导肺腺癌EMT的细胞模型构建及转录组学数据库建立在本部分研究中,我们首先要构建CAF(Carcinoma-Associated Fibroblasts,癌相关成纤维细胞)诱导肺腺癌EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮间充质转化)的细胞模型,来模拟体内肺癌细胞与成纤维细胞细胞相互作用的真实过程。细胞模型先采用人肺腺癌细胞A549的分泌液去诱导人胎肺成纤维细胞WI38使其转化为CAF,之后收集CAF分泌液去诱导A549使其EMT,我们采用免疫印迹、免疫荧光、侵袭实验等技术手段对该细胞模型进行鉴定。然后,利用RNA-seq技术对EMT过程中的不同时间点的肺腺癌细胞的进行转录组学测序,建立完善的转录组学数据库,为发现潜在的EMT生物标志物和肺癌转移治疗靶点提供了可能。2.转录组学数据的生物信息学分析及关键分子的筛选和初步验证在本部分研究中,我们首先要利用WGCNA(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,加权基因共表达网络分析)生物信息学分析手段,对肺腺癌EMT转录组学数据进行全面分析,锁定与EMT发生相关的关键分子。然后,对生物信息学分析锁定的关键分子进行细胞模型水平和TCGA(The Cancer Genome Atlas,肿瘤基因组图谱)临床数据水平的初步验证,为后续复杂的分子机制研究提供更加可靠的候选分子。3.GALNT6促进肺腺癌细胞EMT的分子机制研究在本部分研究中,我们首先要利用免疫组化技术检测GALNT6(Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 6,多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶6)在肺腺癌临床样本中的表达情况,并分析其表达量与临床指标的相关性;其次,我们要通过免疫印迹、免疫荧光、划痕实验、侵袭实验和动物实验等手段检测GALNT6的表达在体外和体内实验中对肺腺癌细胞EMT表型、侵袭和转移的作用;最后,我们要通过细胞水平实验揭示其潜在的分子机制,从而为GALNT6作为EMT生物标志物和肺癌治疗的新靶点提供有力的证据支撑。结果:1.CAF诱导肺腺癌EMT的细胞模型构建及转录组学数据库建立在本部分研究中,我们首先成功构建了CAF诱导肺腺癌EMT的细胞模型。用人肺腺癌细胞A549的分泌液去诱导人胎肺成纤维细胞WI38 24小时后,发现α-SMA和FAP这两个癌相关成纤维特异性标志物表达明显增高,说明正常成纤维细胞在肺癌细胞分泌液的作用下,转化为了CAF。之后收集CAF分泌液去诱导人肺腺癌细胞A549 72小时,发现EMT标志物E-cadherin显著下调、Vimentin显著上调,说明肺腺癌细胞A549在CAF分泌液的作用下发生了EMT,侵袭转移能力增强。接下来,应用RNA-seq技术对肺腺癌EMT过程中的6个时间点(3小时?6小时?12小时?24小时?48小时和72小时)下的实验组与对照组进行了转录组学测序,成功建立了完善的转录组学数据库,为发现潜在的EMT早期生物标志物和肺癌转移治疗靶点提供了可能。2.转录组学数据的生物信息学分析及关键分子的筛选和初步验证在本部分研究中,我们首先通过WGCNA方法分析肺腺癌EMT的转录组学数据,锁定了GBX、HES7、L3MBTL1、CITED1、NFE2、SPARC、TMEM37、GALNT6、CACNB2等一些关键基因,可能作为潜在的早期EMT生物标志物。然后,通过细胞模型水平和TCGA临床数据水平的初步验证,发现GALNT6、SPARC和HES7可能在肺腺癌早期EMT启动过程中发挥作用,也为后期深入的转移分子机制研究提供了新的思路。3.GALNT6促进肺腺癌细胞EMT的分子机制研究在本研究中,我们首先发现GALNT6在肺腺癌组织中中高表达,并且GALNT6的高表达与肿瘤临床的T期、N期、TNM期和不良预后显著相关。其次,我们探讨了GALNT6在体外和体内对EMT表型及功能的影响,当GALNT6过表达时,肿瘤细胞EMT的能力增强,肿瘤细胞的侵袭转移能力也明显增强;当GALNT6被敲低时,肿瘤细胞EMT的能力减弱,肿瘤细胞的侵袭转移能力也明显减弱。最后,我们揭示了肺腺癌细胞EMT潜在的分子机制,GALNT6通过O-糖基化增强了GRP78(Glucose-Regulated Protein 78,葡萄糖调节蛋白78)的稳定性,稳定的GRP78又通过MEK/ERK信号通路调节EMT,促进了肿瘤的侵袭和转移。结论:1.本研究成功构建了CAF诱导肺腺癌EMT的细胞模型,同时成功建立了肺腺癌EMT的转录组学数据库。2.本研究通过WGCNA生物信息学分析及初步验证,发现GALNT6、SPARC和HES7可能在肺腺癌早期EMT启动过程中发挥重要作用。3.本研究揭示了肺腺癌EMT的潜在分子机制,GALNT6是通过GRP78-MEK-ERK途径促进肺腺癌细胞的侵袭转移,故GALNT6-GRP78可作为一种有前景的抗肿瘤转移治疗的新靶点。