肝脏作为脊椎动物重要的消化和代谢器官拥有显著的再生能力。在急性和轻度肝脏损伤的情况下,成熟的肝细胞和胆管上皮细胞通过其强大的增殖能力可以帮助恢复肝脏的体积和功能。虽然正常肝脏有很强的再生能力,但在急性损伤或肝脏切除后,这种强大的再生能力在两种基本情况下会遭到严重削弱:一种是出现严重急性肝损伤,另一种是伴随肝脏结构异常和明显的肝纤维化的出现严重的慢性肝损伤。这些异常情况具有临床上的相关性,并且通常会导致严重的发病率和死亡率。虽然对控制正常肝脏再生的相关信号途径等已经有了数十年的研究,但当异常情况的肝脏再生相关的机制还不太清楚。了解在严重受损的肝脏中再生如何受损是一个重要的目标,从相关动物模型中得到的经验可能在临床环境中具有重要意义,并有助于开发新的治疗方法,以促进再生或预防肝脏再生过程中出现的修复缺陷。目前,在严重的肝脏疾病中,一类被称为双潜能前体细胞的独特细胞类型被鉴定出来,这类细胞同时具有成熟肝细胞和胆管上皮细胞的细胞特征。最近的研究发现,在极端的肝细胞损伤和肝细胞增殖能力缺失的情况下,胆管上皮细胞可以去分化成为双潜能前体细胞,随后双潜能前体细胞再分化为成熟的肝细胞和胆管上皮细胞帮助肝脏再生。这种肝脏再生的方式在小鼠和斑马鱼中都有过广泛报道,被称为胆管上皮细胞驱动的肝脏再生。鉴于胆管上皮细胞向肝细胞的转分化在严重肝脏损伤的再生中发挥着至关重要的作用,对胆管上皮细胞驱动的肝脏再生的机制进行深入的研究和阐释是重要且必要的。肝脏再生的过程和调控机制在脊椎动物的不同物种间具有较高的保守特征,而斑马鱼作为理想的脊椎动物模型也已经被应用于肝脏再生的研究之中。斑马鱼幼体的肝脏功能,如胆汁分泌、血清蛋白分泌和脂肪生成等在受精后五天就可以与成年体一样完全运作。因此,受精后五天的斑马鱼幼鱼可以被用于肝脏再生的研究。细菌硝基还原酶（NTR）可以将原药甲硝唑（Mtz）转变为具有细胞毒性的DNA交联剂,NTR/Mtz系统也已被成功用于建立条件性靶向细胞消融和再生的斑马鱼模型。本课题组和其他课题组各自独立地条件性消除了斑马鱼的全部肝细胞,在此基础上进行了诸多关于胆管上皮细胞驱动的肝脏再生研究。之前部分研究发现BMP信号通路、Notch信号通路、mTORCl信号通路、BET蛋白、Hdacl和FXR在胆管上皮细胞驱动的肝脏再生过程中发挥重要作用。另一方面,我们和其他课题组也发现在肝脏再生过程中,调控肝脏发育的多个转录因子会重新启动激活,其中包括Hhex、Foxa3和Sox9b。然而,关于这些发育调控因子重新激活的机制以及这些调控因子影响胆管上皮细胞驱动的肝脏再生的方式目前仍然处于未知。Tel2起初被发现于一个具有截短端粒的酵母突变品系之中。之后不同模式生物中的Tel2同源基因也被鉴定出来,分别是:线虫的Rad-5/Clk-2、果蝇的LqfR、哺乳动物的hClk2/Telo2以及植物的Tel2。这些Tel2同源基因编码的蛋白质具有高度保守的氨基酸功能域:端粒长度调节域。最初,Tel2蛋白被发现在酵母和线虫中具有端粒长度调节的功能和端粒DNA定位的功能。然而,在对哺乳动物Tel2的研究中发现,哺乳动物的Tel2缺乏明显的端粒相关功能。此外,Tel2在所有真核生物中具有另一个保守的功能:作为一种辅助蛋白用于促进磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶（PIKK）家族蛋白质的组装、稳定和维持。PIKK家族包括多种蛋白质,其中ATM、ATR、DNA-PK是参与DNA损伤和复制压力反应相关因子,SMG1是参与无义mRNA的降解调节的相关因子,TRRAP是直接参与调控转录相关的蛋白质,mTOR是一种应对环境影响和压力的细胞代谢和增殖的调节因子。在真核生物（包括斑马鱼）的细胞活动中,Tel2可能通过影响PIKK蛋白家族发挥时空和组织特异性的功能,但目前对于Tel2在胆管上皮细胞驱动的肝脏再生中发挥的作用知之甚少。在本研究中,我们利用斑马鱼作为模式生物研究脊椎动物肝脏再生的分子机制,利用NTR/Mtz系统特异性诱导肝细胞损伤,构建了严重肝细胞损伤后胆管上皮细胞驱动的肝脏再生的斑马鱼模型。结合大规模N-乙基亚硝基脲（ENU）介导的正向遗传筛选手段,探寻能够特异性影响斑马鱼肝脏再生的重要基因。最终我们发现一个稳定遗传的突变体liver logan（lvl）cq122,其在发育过程中会表现出不成熟的鱼鳔。而通过对cp10a、fabp10a、fabp2和trypsin的全胚胎原位杂交显色发现,lvl突变体的肝脏、肠道以及胰外的早期发育在第五天前都表现正常,但lvl突变体的肝脏再生表现出严重的缺陷,因此我们认为lvl是一个特异的肝脏再生缺陷突变体。通过图位克隆技术,我们发现lvl基因的突变位点位于tel2基因,突变导致Tel2蛋白的翻译被提前终止。通过全胚胎原位杂交显色和荧光原位杂交偶联抗体显色,我们发现tel2在肝脏再生时的胆管上皮细胞和后续的胆管上皮衍生细胞中持续高表达。我们利用CRISPR/Cas9系统成功构建的另一个tel2突变体品系tel2cq123同样会表现出严重的再生肝脏缺陷。而通过转基因鱼品系Tg（hsp70l:Tel2-GFP）cq125热激过表达野生型Tel2则能够回救lvl突变体的肝脏再生缺陷。因此可以确定正是由tel2基因的突变引起了lvl突变体肝脏再生缺陷的表型。通过对Proxl和Hnf4a的检测,我们发现tel2突变不会影响胆管上皮细胞驱动的肝脏再生过程中的胆管上皮细胞去分化过程。而BODIPYFLC5显色,cp、gc的全胚胎原位杂交显色以及Bhmt、Alcam的抗体显色结果表明tel2突变严重阻碍了斑马鱼胆管上皮细胞驱动的肝脏再生过程中双潜能前体细胞再分化过程。利用染色质免疫共沉淀PCR检测和斑马鱼体细胞端粒长度检测,我们发现斑马鱼Tel2没有表现出明显的端粒定位功能,并且tel2突变不会影响斑马鱼体细胞端粒长度的稳定,说明Tel2在斑马鱼胆管上皮细胞驱动的肝脏再生中的作用应该与端粒相关功能无关。通过全胚胎原位杂交显示和荧光原位杂交偶联抗体显色,对斑马鱼胆管上皮细胞驱动的肝脏再生过程中肝脏发育关键标记基因的重激活进行检测后,我们发现tel2突变不影响foxa3和sox9b的重新转录,但是会严重抑制hhex转录的重新激活。利用Tg（sox17:GFP）s870转基因鱼系,我们发现tel2在早期内胚层中几乎没有表达,说明Tel2能够特异地在肝脏再生过程中调节hhex转录的重新启动。同时,利用CRISPR/Cas9系统构建的hhexcq125杂合突变体在肝脏再生48小时表现出相对更小的肝脏,并且原位杂交显色结果显示cp、gc和bhmt的表达量在hhexcq125杂合突变体中严重下降,抗体显色表明Bhmt的表达在hhexcq125杂合突变体的双潜能前体细胞中也被抑制,hhex杂合突变体会表现出与tel2纯合突变体相似的肝脏再生缺陷。利用Tg（hsp70l:Hhex-GFP）cq127转基因斑马鱼热激后过表达野生型Hhex,我们发现过表达Hhex能够部分回救lvl突变体的肝脏再生缺陷,并且成熟肝细胞标记物的表达在lvl突变体的再生肝脏中有所回升。在基于Cre/loxP系统的Tg（tp1:CreER T2）jh12和 Tg（hsp70l:loxP-m Cherry-STOP-loxP-Hhex-Myc）cq128的转基因斑马鱼品系肝脏再生过程中,我们发现胆管上皮细胞特异性过表达Hhex同样能够缓解lvl突变体的肝脏再生缺陷,说明Tel2是以细胞自主的方式通过Hhex来影响斑马鱼肝脏再生的过程。通过对PCNA、γH2AX的抗体显色和TUNEL标记的检测,我们发现tel2突变体的胆管上皮衍生细胞在肝脏再生0小时的增殖就开始减少,甚至在再生24小时和48小时时几乎检测不到双潜能前体细胞的增殖能力,但tel2突变并不会诱导斑马鱼再生肝脏产生细胞凋亡。而在过表达Hhex之后,胆管上皮细胞和胆管上皮衍生细胞的增殖能力在tel2突变体中得到部分回救。综上所述,我们发现了一个新的tel2斑马鱼突变体,它可以特异性地导致斑马鱼肝脏再生出现缺陷。进一步的研究发现,tel2通过调节双潜能前体细胞的再分化和增殖来影响胆管上皮驱动的肝脏再生。我们还发现,tel2突变体肝脏再生的缺陷与hhex转录重新激活的阻断有关。最终本研究表明,Tel2/Hhex途径对胆管上皮细胞驱动的肝脏再生是必要的。