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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）催化将腺苷三磷酸（ATP）和1-磷酸葡萄糖（Glc-1-p）转化为成腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-Glc）和焦磷酸,该反应是玉米淀粉生物合成中的关键限速步骤。以前的研究表明,AGPase调节主要存在三种机制,分别是氧化还原调控、温度调节和小分子变构调节。然而,通过研究发现AGPase存在磷酸化,可能为一种新的调节机制。主要获得了以下结果:（1）制备和评价了Sh2和Bt2兔源多克隆抗体。通过AGPase大小亚基Sh2和Bt2基因克隆、原核表达载体pGEX-6T-1-Sh2和pGEX-6T-1-Bt2的构建及GST重组蛋白表达纯化,将纯化得到的融合蛋白GST-Sh2和GST-Bt2免疫新西兰大白兔,制备了Sh2和Bt2多克隆抗体。用rTEV蛋白酶去除GST-Sh2和GST-Bt2融合蛋白的GST标签,并用Sh2和Bt2抗体进行western blot检测。结果表明制备的Sh2和Bt2抗体具有较高特异性和灵敏性,可用于检测纳克级抗原蛋白。用免疫前血清、Sh2和Bt2抗体对授粉后20天的玉米胚乳蛋白进行western blot检测。结果表明免疫前血清检测不到Sh2和Bt2蛋白,Sh2和Bt2抗体可以检测。因此Sh2和Bt2抗体是制备成功的。Sh2和Bt2抗体免疫沉淀授粉后的20天胚乳蛋白,并进行western blot检测。结果显示Sh2和Bt2抗体能特异地免疫沉淀AGPase大小亚基。Bt2抗体免疫沉淀授粉后15、20和27天的玉米胚乳蛋白,并进行质谱分析。结果表明Bt2抗体能够免疫沉淀Bt2。总之,这些结果表明制备的Sh2和Bt2抗体在体内外具有很好的特异性。（2）玉米Sh2和Bt2蛋白时空表达分析。通过Sh2和Bt2多克隆抗体检测玉米授粉过程中不同阶段的胚乳Sh2和Bt2蛋白表达水平及玉米Bt2在不同组织的表达情况。结果表明Sh2和Bt2的表达模式与淀粉积累模式相符,Bt2蛋白具有组织特异性。（3）AGPase亚基磷酸化的检测。实验分为三组,第一组为授粉后15、20和27天玉米胚乳蛋白,作为对照组;第二组为Phos-tag TM技术富集的15、20和27天玉米胚乳磷磷酸化蛋白;第三组为Sh2和Bt2抗体免疫沉淀的15、20和27天玉米胚乳蛋白;使用磷酸化蛋白染色技术Pro-Q diamond staining分别对这三组进行染色,并用Bt2特异性抗体western印迹进行验证。结果表明AGPase小亚基Bt2可以通过对磷酸化蛋白特异的Pro-Q diamond staining技术进行染色,Bt2发生了磷酸化。（4）AGPase亚基去磷酸化及玉米胚乳不同授粉阶段Bt2磷酸化水平分析。实验分为两组,第一组用Phos-tag TM技术富集授粉后15、20和27天玉米胚乳蛋白,第二组用Phos-tag TM技术富集碱性磷酸酶处理后的15、20和27天胚乳蛋白,然后两组用Sh2和Bt2抗体通过western印迹检测AGPase亚基Sh2和Bt2。结果表明在Phos-tag TM技术富集的磷酸化蛋白中可以检测到AGPase亚基Sh2和Bt2。相反,碱性磷酸酶处理后的胚乳蛋白中,结果检测不到Sh2和Bt2或含量减少。为了检测Bt2蛋白的磷酸化水平,用Phos-tag TM技术富集授粉后不同阶段玉米胚乳蛋白,并用Bt2抗体进行western印迹分析。结果表明Bt2蛋白的磷酸化水平在玉米授粉过程中与Bt2的表达水平及淀粉的积累模式一致。（5）AGPase亚基Bt2磷酸化位点的鉴定。iTRAQTM鉴定Bt2的磷酸化位点,Bt2-Ser10和Bt2-Thr451和Bt-Thr473被磷酸化。生物信息学分析显示Bt2-Thr 451和Bt2-Thr 473在选择的植物中是保守的,Bt2-Ser10是玉米所特有的。（6）Bt2抗体免疫共沉淀15、20和27天玉米胚乳蛋白并质谱分析相互作用蛋白及可能的激酶。结果显示这三个时期胚乳蛋白都与Bt2相互作用的蛋白有Legumin1、Glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 1、Binding protein homolog2、Heat shock 70 kDa protein 3、1 4-alpha-glucan-branching enzyme2、Pyruvate orthophosphate dikinase2、Pyruvate phosphate dikinase、60S acidic ribosomal protei、Actin-1和Sorbitol dehydrogenase等,其中PPDK是激酶。在授粉后15天与Bt2相互作用的激酶还有Protein kinase homolog2和Serine/threonine-protein kinase,20天还有ATP-dependent 6-phosphofructokinase 3,27天还有Putative receptor-like protein kinase。表明AGPase的磷酸化是复杂的,淀粉积累过程中既有其必须激酶,不同阶段又有特定的激酶调控。（7）去磷酸化对AGPase活性的影响及潜在的磷酸化调控机制。实验分为两组,第一组为授粉后20天的玉米胚乳蛋白,作为对照,第二组为碱性磷酸酶处理后的20天玉米胚乳蛋白,并使用活性凝胶来分析AGPase活性。结果表明AGPase通过碱性磷酸酶处理的去磷酸化作用在活性凝胶检测中降低其活性。据此推测潜在的调节模式为激酶催化AGPase的磷酸化将增强其活性,碱性磷酸酶催化的AGPase的去磷酸化会抑制其活性。综上所述,AGPase的磷酸化可能在籽粒淀粉积累阶段出现,AGPase的磷酸化可能是淀粉合成过程中调控AGPase活性的新模式。