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病毒性心肌炎（Viral Myocarditis,VMC）和病毒相关扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy,DCM）是临床上最常见且严重威胁人类健康的病毒性心脏病（viral heart disease,VHD）。有学者认为VMC、DCM实际是一种疾病的两个阶段。柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3,CVB3）是最常见导致VMC的原因。研究表明,自身免疫激活被认为是VMC演变为DCM的主要发病机制。B1细胞属于固有免疫细胞,起源于胚胎早期,主要分布在浆膜腔,具有自我更新能力。B1细胞包括B1a和B1b两种亚群。B1a细胞主要通过分泌天然IgM抗体、白细胞介素-10（Interleukin 10,IL-10）等多种细胞因子参与固有免疫和适应性免疫应答。动物实验和临床研究表明,B1细胞,特别是B1a细胞参与多种感染性疾病、慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病过程,并在其中发挥着不同的免疫调节作用。我们前期研究表明,未分型的B细胞和产IL-10的B细胞亚群参与VMC和DCM的发病过程。B1和B1a细胞作为重要的B细胞亚群是否参与VMC和DCM的发病?在其中的作用及其机制如何?目前尚未见报道。为了进一步研究VMC向DCM演变的发病机制,寻求新的治疗思路和干预靶点,本研究拟通过建立B1a细胞缺乏的VMC小鼠模型,同时收集DCM病例进行以下3方面研究:第一部分B1和B1a细胞在小鼠病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变过程中的变化研究一病毒性心肌炎及扩张型心肌病小鼠模型的建立目的:建立VMC和DCM小鼠模型,观察从VMC向DCM演变过程中小鼠心脏的结构、功能和病理改变。方法:4-5周龄雄性BALB/c小鼠180只,随机分为病毒性心脏病组（VHD,n=120）和对照组（n=60）。每组再分为6个亚组（1周、2周、4周、6周、8周、24周）。VHD各亚组采用腹腔注射心肌细胞传代的CVB3稀释液建立VMC和DCM小鼠模型,对照组小鼠腹腔注射等量磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline,PBS）。在相应的时间点应用动物超声评估小鼠心脏结构和功能,制作小鼠心脏病理切片,观察心肌病理组织学改变。结果:与对照组比较,VHD组小鼠CVB3感染第1周开始出现左室收缩末内径（Left ventricular end systolic diameter,LVESD）进行性扩大,伴有左室短轴缩短分数（Left ventricular fractional shortening,LVFS）和左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）持续性降低,第4周后出现左室舒张末内径（Left ventricular end diastolic inner diameter,LVEDD）显著进行性扩大（P＜0.05或P＜0.01）。24周时上述超声指标改变最显著（P＜0.05或P＜0.01）。心脏病理切片显示VHD组小鼠第1周出现心肌细胞肿胀、坏死、间质炎症细胞浸润,第2周时达峰并开始出现心肌间质纤维化,24周时左室扩大、心肌间质纤维化最严重。VHD组1至8周亚组心肌病理积分和4至24周亚组胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）均显著高于同时点对照组（P＜0.01）。结论:腹腔接种心肌传代CVB3稀释液可以建立急性VMC、慢性VMC和DCM系列小鼠模型。小鼠从VMC向DCM演变过程中,心肌炎症表现为先重后轻,心肌间质纤维化呈进行性加重,同时伴有进行性左心室的扩大和左心收缩功能降低。研究二B1和B1a细胞在小鼠病毒性心肌炎向扩张型心肌病演变过程中的变化目的:观察VMC向DCM演变过程中小鼠腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例及血浆IgM、IgG和白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）水平的变化。方法:实验动物、分组方法、模型建立方法同本部分研究一。在相应时点处死小鼠,收集血浆、腹膜和脾脏细胞。采用流式细胞术检测各组小鼠腹腔和脾脏B1、B1a细胞比例,酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定血浆IgM、IgG和IL-10水平。结果:与对照组相比较,VHD组小鼠感染CVB3后腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例均在第1周开始显著升高,第2周达峰后呈进行性降低,第24周时降至最低（P＜0.05）。腹膜和脾脏B1b细胞较对照组无显著改变（P＞0.05）。VHD组小鼠血浆IgM在第1周升高并达峰,随后逐渐降低,第8周后低于对照组（P＜0.05或P＜0.01）;血浆IL-10在第1周升高并达峰（P＜0.01）,4周后恢复至对照组水平。血浆IgG在第1周开始升高（P＞0.05）,第4周时达峰（P＜0.01）,第6至8周仍高于对照组水平（P＜0.05）,24周时恢复至对照组水平（P＞0.05）。结论:小鼠VMC急性期腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例均显著升高并达峰,同时伴血浆IgM和IL-10升高;慢性期后腹膜和脾脏B1和B1a细胞比例呈进行性降低,DCM期最低,血浆IgM也随之降低。第一部分结论:小鼠VMC向DCM演变过程中,腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例在VMC急性期随心肌炎症的加重而增高,伴血浆IgM、IL-10水平升高;VMC慢性期后腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例呈进行性降低,DCM期最低,血浆IgM也随之减少。因此,B1、B1a细胞参与了小鼠VMC向DCM演变的全过程,其中B1a细胞可能在病程中发挥主导作用。第二部分B1a细胞在小鼠急性和慢性病毒性心肌炎中的作用及机制研究一B1a细胞缺乏小鼠模型的建立目的:建立出生和成年B1a细胞缺乏的两种小鼠模型,分别观察B1a细胞缺乏对小鼠的影响。方法:新生雄性BALB/c小鼠40只,随机分为出生B1a细胞缺乏组（N-B1D,n=20）和出生对照组（N-CON,n=20）。7周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为成年B1a细胞缺乏组（A-B1D,n=10）和成年对照组（A-CON,n=10）。采用反复腹腔注射超纯水的腹膜低渗休克法清除小鼠腹膜B1a细胞。N-B1D、A-B1D两组小鼠分别从出生、7周龄开始建立B1a细胞缺乏模型,而各自的对照组则注射等量无菌PBS。N-B1D、A-B1D两组小鼠分别在6周龄和12周龄时应用流式细胞术检测腹腔和脾脏B细胞、T细胞和巨噬细胞的比例,动物超声评估小鼠心脏结构和功能,ELISA检测血浆IgM、IgG和IL-10水平,制作心脏病理切片观察心肌病理组织学变化。结果:与各自的对照组比较,N-B1D和A-B1D组小鼠腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例显著减少,血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。然而,腹膜和脾脏B1b、B2、T和F4/80+巨噬细胞比例,血浆IgG和IL-10水平,LVESD、LVDDD、LVFS、LVEF,心肌病理积分和CVF均未受影响（P＞0.05）。结论:腹膜低渗休克法可以造成腹膜和脾脏B1a细胞减少但不影响其他免疫细胞数量,因此,该方法能成功建立出生和成年B1a细胞缺乏小鼠模型。B1a细胞缺乏后,导致小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量降低,但对血浆IgG、IL-10,心脏结构、功能和病理组织学均无影响。研究二B1a细胞在小鼠急性病毒性心肌炎中的作用及机制目的:探讨B1a细胞在小鼠急性VMC的作用及其机制。方法:新生雄性BALB/c小鼠70只,随机分为出生B1a细胞缺乏组（N-B1D,n=20）、出生B1a细胞缺乏+B1a细胞过继组（B1a+B1D,n=20）、VMC对照组（VMC-CON,n=20）和空白对照组（CON,n=10）。采用腹膜低渗休克法,从出生开始对N-B1D组和B1a+B1D组小鼠建立B1a细胞缺乏的模型。4周龄时,除CON组外,其余三组小鼠均腹腔接种心肌传代CVB3建立VMC模型。其中B1a+B1D组在建立VMC小鼠模型前3日过继健康BALB/c小鼠的腹膜B1a细胞,过继后停止腹腔注射超纯水。VMC 2周时,应用动物超声评估小鼠心脏结构和功能;ELISA检测血浆IgM、IgG和IL-10水平;制作心脏病理切片对心肌病理组织学进行分析。结果:与CON组比较,N-B1D、B1a+B1D和VMC-CON组小鼠LVESD明显扩大,LVFS、LVEF显著降低,血浆IgM、IgG和IL-10水平均升高,心脏病理积分和CVF增高,心脏IgM、IL-10表达量增多（P＜0.05或P＜0.01）。与B1a+B1D和VMC-CON组比较,B1a细胞缺乏的N-B1D组LVESD最大,LVFS、LVEF最低,心脏病理积分最高,血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量相对降低（P＜0.05或P＜0.01）。然而,B1a+B1D和VMC-CON组之间上述指标无显著性差异（P＞0.05）。结论:B1a细胞缺乏的急性VMC小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量相对减少,心肌炎症重,左室收缩功能降低。过继B1a细胞后可以逆转B1a细胞缺乏小鼠VMC急性期上述改变。因此,在小鼠VMC急性期,B1a细胞可能通过调节血浆IgM和心脏IgM、IL-10的表达,减轻心肌炎症,阻止左室扩大和收缩功能降低,从而发挥保护作用。研究三B1a细胞在小鼠慢性病毒性心肌炎中的作用及机制目的:探讨B1a细胞在慢性VMC小鼠中的作用和可能的机制。方法:4周龄雄性BALB/c小鼠25只,随机分为成年B1a细胞缺乏组（A-B1D,n=15）和成年VMC对照组（A-VMC,n=10）。新生雄性BALB/c小鼠40只,随机分为出生B1a细胞缺乏组（N-B1D,n=20）和出生B1a细胞缺乏+B1a细胞过继组（B1a+B1D,n=20）。采用心肌传代的CVB3对A-B1D组和A-VMC组小鼠建立VMC模型,VMC 3周后对A-B1D组小鼠建立B1a细胞缺乏的小鼠模型,而A-VMC组则注射等量PBS。这两组小鼠用于观察VMC慢性期B1a细胞缺乏对小鼠的影响。N-B1D组和B1a+B1D组小鼠则从出生建立B1a细胞缺乏的模型,4周龄时建立VMC模型,VMC 3周时B1a+B1D组小鼠过继健康BALB/c小鼠腹膜B1a细胞。这两组小鼠用于观察出生B1a细胞缺乏的小鼠在VMC慢性期过继B1a细胞对小鼠的影响。各组小鼠均在VMC 8周时,应用动物超声评估小鼠心脏结构和功能;ELISA检测血浆IgM、IgG和IL-10水平;制作心脏病理切片对心肌病理组织学进行分析。结果:与A-VMC对照组比较,B1a细胞缺乏的A-B1D组小鼠LVESD增大,LVFS和LVEF降低,CVF升高,血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。与N-B1D对照组比较,VMC慢性期过继B1a细胞的B1a+B1D组小鼠LVESD和LVEDD减小,LVFS和LVEF升高,CVF降低,血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达量均显著增多（P＜0.05或P＜0.01）。结论:VMC慢性期B1a细胞缺乏小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10表达减少,心肌纤维化增加,左室收缩功能降低。B1a细胞缺乏的小鼠在VMC慢性期过继B1a细胞后仍可以逆转上述变化。因此,在小鼠VMC慢性期,B1a细胞可能通过调节血浆IgM和心脏IgM、IL-10的表达,抑制心肌间质纤维化,阻止左室扩张和收缩功能降低,从而发挥保护作用。第二部分结论:小鼠VMC急性期和慢性期B1a细胞缺乏造成小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10的表达量减少,心肌炎症加重,心肌间质纤维化增多,左室收缩功能障碍。因此,B1a细胞可能通过调节VMC小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10的表达,减轻心肌炎症,抑制心肌间质纤维化,保护左室收缩功能,在小鼠VMC向DCM演变全过程中均发挥保护作用。第三部分B1细胞在扩张型心肌病患者外周血中的变化及临床意义目的:观察DCM患者外周血中B1细胞的变化及临床意义。方法:本研究纳入原发性DCM患者27例（DCM组）,心衰患者18例（HF组）,健康受试者21例（HC组）。应用多色流式细胞术检测外周血B1细胞比例,ELISA检测血浆IgM、IgG和IL-10浓度。此外,收集氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-pro BNP）、高敏C反应蛋白（hypersensitive-CRP,hs-CRP）和LVEF等临床数据进行相关性分析。结果:与HF、HC组相比,DCM组B1细胞比例明显减少。三组血浆总IgM、IgG和IL-10水平无显著差异。DCM患者外周血B1细胞比例与LVEF呈正相关,与NT-pro BNP呈负相关。结论:DCM患者外周血B1细胞比例减少,B1细胞的比例与疾病严重程度密切相关,提示B1细胞可能与DCM发病有关。全文总结1.腹腔接种心肌传代CVB3稀释液可以建立急性VMC、慢性VMC和DCM系列小鼠模型。2.小鼠VMC向DCM演变过程中,腹膜和脾脏B1、B1a细胞比例在VMC急性期随心肌炎症的加重而增高,慢性期开始进行性降低,DCM期最低。提示B1、B1a细胞参与了小鼠VMC向DCM演变的全过程,其中B1a细胞可能在病程中发挥主导作用。3.B1a细胞可能通过调节VMC小鼠血浆IgM和心脏IgM、IL-10的表达,减轻心肌炎症,抑制心肌间质纤维化,保护左室收缩功能,在小鼠VMC向DCM演变全过程中均发挥保护作用。4.DCM患者外周血B1细胞比例减少,B1细胞的比例与疾病严重程度密切相关,提示B1细胞可能与DCM发病有关。