丁二酸，又名琥珀酸，化学式为C4H6O4，是一种优秀的C4平台化合物，被广泛应用于制备各药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物。传统化学法合成以不可再生资源石油为原料，成本高，环境污染严重。微生物发酵法生产丁二酸，以可再生资源糖为原料，具有成本低，环境污染小的优点。因此进行丁二酸的生物法研究具有极大的现实意义。　　由于丁二酸有氧培养阶段为三羧酸循环代谢中间产物积累较少，因此一般采用两阶段培养模式生产丁二酸，有氧阶段提高菌体浓度，厌氧发酵产酸。厌氧阶段产生副产物如乙酸、乳酸、甲酸等降低原料利用率。为提高丁二酸得率，降低副产物产量，同时增强丁二酸合成途径成为构建高产菌株主要手段。本文以大肠杆菌AFP111为出发菌株，进行乙酸合成基因敲除，同时过表达关键基因提高丁二酸得率。首先敲除乙酸激酶和磷酸转乙酰酶(其编码基因为ackA-pta)获得SX01菌株乙酸产量下降了44.86％，丁二酸得率增加了4.55％。在SX01菌株基础上，敲除苏氨酸脱酸酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶(其编码基因分别为tdcD和tdcE)获得菌株SX02，乙酸产量减少了15.53％，丁二酸得率提高了5.07％，生产效率下降13.16％。随后为提高糖转运速率，对编码葡萄糖激酶的基因glk启动子改造获得菌株SX03，较SX02的Glk酶活性提升3.66倍，葡萄糖利用率由0.69g/(L·h)增至1.04g/(L·h)，丁二酸得率提高8.28％，生产效率提高62.12％，乙酸产量下降31.62％。在SX03菌株的基础上进行编码半乳糖转运体galp进行改造，利用运动单胞菌株密码子优化后的葡萄糖促进蛋白，其编码及因为glf替换galp基因，获得的菌株SX04并无明显效果，反而使Glk酶活性降低了3.97倍，糖利用效率下降，丁二酸得率下降5.73％，此时该替换并无显著效果，可能由于选择启动子启动效率过低。随后以SX03为出发菌株进行磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因pck启动子改造后获得菌株SX05，Pck酶活性提高10.58倍，但其丁二酸得率下降4.46％，该菌株Glk酶活性下降45.13％，可能由于Pck催化产生ATP，Glk酶活性受ATP含量调控，ATP含量过高，使得Glk酶活性被抑制，糖转运效率下降，进而导致丁二酸得率下降。　　选择高产丁二酸菌株SX03进一步放大，首先以碱式碳酸镁为pH调节剂5L罐发酵，厌氧阶段SX03相比AFP111乙酸产量减少75.76％，生产效率提高72.52％，丁二酸得率1.62mol/mol，提高了19.12％。其次，为降低生产成本以NaOH和Na2CO3替换碱式碳酸镁，优化厌氧发酵阶段pH、搅拌转速、初始葡萄糖浓度，优化结果表明当厌氧阶段pH为6.8、初始葡萄糖含量为100g/L、搅拌转速为250r/min，产生丁二酸72.33g/L，得率为1.66mol/mol，乙酸产量为2.24g/L。最后，将该菌株进行100L发酵罐初步放大验证，结果表明厌氧67h，丁二酸产量为51.95g/L，体积为82L，乙酸产量为1.91g/L，丁二酸得率为1.30mol/mol，生产效率为0.79g/(L·h)。　　通过代谢工程改造的大肠杆菌，其乙酸副产物含量显著下降、丁二酸得率提高，并在5L和100L发酵罐上实现工艺放大，展现出较大工业化利用潜力。