一、目的与意义癫痫是一组由多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所引起的以短暂中枢神经系统功能失常为特征的临床综合征。癫痫的患病率各国不一,总体而言,发达国家相对偏低,而发展中国家偏高,我国的患病率呈中等水平,我国流行病学资料显示,我国癫痫的患病率为3.5‰～4.8‰,而发病率约23／(10万·年)左右,据此推算,我国每年有新发病人数达30余万,估计已有癫痫病人约455万～630万人。因此对癫痫的治疗是一项十分艰巨而又十分重要的任务。目前控制癫痫仍以化学药物(AEDS)为主,常用一线抗癫痫药如苯妥英钠、丙戊酸钠、卡马西平等可使70%～80%的癫痫患者发作得以控制,但由于这些药物药代动力学的局限性及耐受性、致畸的可能性、严重皮疹、对肝脏的毒副作用,以及对认知功能产生的不良作用而导致癫痫患者生活质量下降等因素,限制了其应用。而新的抗癫痫新药,如加巴喷丁、拉莫三嗪、奥卡西平等,患者对其耐受性较传统抗癫痫药物大大降低,但由于费用较一线抗癫痫药物昂贵,目前临床应用也受到限制。而20%左右的癫痫患者对各种疗法包括药物、癫痫手术、迷走神经刺激术等耐受,这就需要研发新的抗癫痫药物。既往研究表明：中药可通过调节神经递质、调控离子通道、抑制神经胶质细胞增生、清除自由基等实现抗癫痫作用。研究中药复方对癫痫的作用,可以了解中药复方抗癫痫的机制。戊四氮(PTZ)惊厥模型、最大电休克模型(MES)及士的宁惊厥模型是使用较多的癫痫发作模型。能抑制上述三种动物模型惊厥发作的药物,对治疗临床癫痫发作可能有效。PTZ慢性点燃模型的病理学改变与人类颞叶癫痫相似,主要为海马神经细胞丢失、胶质细胞增生、神经元再生、苔藓纤维丝状芽生等,在有些动物,反复癫痫发作引起的突触可塑性改变,可导致认知功能损害及对抗癫痫药物的耐受。目前,PTZ点燃模型已广泛用于筛选抗癫痫药物及癫痫发生机制研究。γ-氨基丁酸(GABA)是神经系统最重要的抑制性神经递质,GABA由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(GAD)脱羧基而成,经GABA能中间神经元突触前神经末梢合成后分泌释放入突触间隙,激活突触后GABA受体,使氯离子通道开放引起突触后膜超极化,产生抑制效应。因此,GABA突触功能的许多阶段与癫痫密切相关,包括GABA合成、GABA释放、GABA转运、GABA受体亚型A、B的激活等。能作用于上述传导通路的药物,具有一定的抗癫痫作用。同病异治法是中医最重要的基础理论之一,中医对癫痫的认识在这方面也有体现,具体表现在治法方面。中医治疗癫痫的方法包括从痰论治、从肝论治和其它诸多方法。从痰论治复方定痫丸和从肝论治复方柴胡疏肝汤均在临床上取得了较好的疗效,而在动物实验上,两种复方的疗效有待验证。因此,本实验观察比较同病异治复方对三种不同急性癫痫模型的效应,及对PTZ慢性点燃大鼠的抑制性神经递质GABA传导通路的影响,以探讨同病异治复方的抗癫痫作用及机制。二、方法与内容1、PTZ急性惊厥大鼠造模及处理60只wistar大鼠,随机分为6组,每组10只,各组大鼠均在造模前灌胃给药,A组给予等容积生理盐水,B组按200mg/(kg·d)给予VPA混悬液,C、D、E组分别按照2.5g/(kg·d)、5g/(kg·d)、10g/(kg·d)灌胃给予柴胡疏肝汤,F组按照12g/(kg·d)灌胃给予定痫丸。连续给药7天,早晚各一次。末次给药1.5h后腹腔注射PTZ溶液(50mg/kg),立即观察大鼠的行为学变化30min,记录发作性阵挛的潜伏期(即Racine标准中3级发作的潜伏期)以及大鼠发作级别的例数。2、电极的埋植及脑电图的记录21只wistar大鼠,随机分为7组,每组3只,各组大鼠均在造模前灌胃给药,A组及G组给予等容积生理盐水,B组按200mg/(kg·d)给予VPA混悬液,C、D、E组分别按照2.5g/(kg·d)、5g/(kg·d)、10g/(kg·d)灌胃给予柴胡疏肝汤,F组按照12g/(kg·d)灌胃给予定痫丸。连续给药7天,早晚各1次。灌胃3天后各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛350mg/kg予以麻醉后,于大鼠海马区和皮质额叶区安装不锈钢电极,并以牙托粉及牙科固定,缝合头皮。连续三天予以庆大霉素抗炎处理。一周后选取左耳为参考电极,单极导联,采用十六道生理信号采集系统描记脑电图,连续描记5min。除G组外,其余各组腹腔注射戊四氮50mg/kg,观测各组动物脑电变化。3、最大电休克惊厥小鼠造模及处理利用YSD-4GA药理生理实验多用仪筛选符合要求的小鼠,齿状夹以生理盐水浸湿后,夹住小鼠两耳尖部,进行交流电刺激,参数设定为100V,0.25S,单次刺激,以后肢强直性伸直为惊厥指标,筛选符合条件的小鼠60只,随机分为6组,分组同前,A组给予等容积生理盐水,B组按400mg/(kg·d)灌胃给予VPA溶液,C、D、E组分别按照3.75g/(kg·d)、7.5 g/(kg·d)、15g/(kg·d)灌胃给予柴胡疏肝汤,F组按照20g/(kg·d)灌胃给予定痫丸。连续给药7天,早晚各一次。在末次给药1.5h后再行上述电刺激,记录其惊厥数,计算惊厥率。4、士的宁急性惊厥小鼠造模及处理选取SPF级昆明小鼠60只,分组及给药方法同MES惊厥小鼠,在末次灌胃给药1.5h后,各组给予士的宁1.5mg/kg腹腔注射,记录小鼠发生强直性惊厥和死亡的例数,计算其惊厥率和死亡率。5、PTZ慢性点燃癫痫大鼠造模及处理运用戊四氮35mg/kg连续腹腔注射3周,每日注射后观察大鼠的发作潜伏期,记录发作级别,以连续至少3次4级或5级以上发作为慢性点燃成功的标准,选取在18±3天左右点燃大鼠,间歇7天后再次刺激,凡有发作的大鼠被认为是完全点燃。取同期饲养正常对照老鼠(每天腹腔注射同等容积的生理盐水)设为A组,再取完全点燃大鼠,随机分为4组,即B、C、D、E组,各组均选用灌胃法给予处理, A组与B组给予等容积生理盐水；C组按200mg/(kg·d)给予VPA溶液；D组按12g/(kg·d)给予中药复方定痫丸；E组按5g/(kg·d)给予复方柴胡疏肝汤,每日2次,连续4周。6、Western blotting法检测GAD65含量4周实验结束时,每组随机取6只大鼠,分离皮层和海马。用细胞裂解液裂解组织。BCA定量后上样。在有足量电泳缓冲液的恒压电泳仪进行电泳(5%积层胶80V,10%分离胶120V)。电泳结束后,转膜、封闭,然后依次加入一抗、二抗,各步骤之间用TBST充分洗涤。最后用ECL显色液浸湿后显像。同上步骤测各组β-actin的蛋白表达。用GAD65/β-actin|的平均灰度值表示GAD65的相对蛋白表达量。7、高效液相法测GABA的含量4周实验结束时,每组随机取6只大鼠,分离皮层和海马。取各组海马组织50mg置于手动匀浆器,加入80%的乙醇5ml匀浆,离心,取上清。沉淀再次加入80%的乙醇5ml,同上离心,取上清。将两次上清液混合,80℃水浴蒸干。用0.1mol/L的盐酸溶液定容至5ml,低温离心,取上清,0.45μm滤膜过滤,取20μl样品进样。8、GABAARα1免疫组化染色4周实验结束时,每组随机取6只大鼠,大鼠灌胃1.5 h后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,经升主动脉先快速灌注冰生理盐水150ml,然后缓慢灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PH 7.2-7.4,4℃) 200ml,冰上取脑,在上述固定液(4℃)中固定24h,再置于20%蔗糖磷酸缓冲液(PH7.4,4℃)中过夜,按常规制备大鼠石蜡切片(含皮层和海马)。每只大鼠取3张断面水平相似的切片,参照试剂盒说明行SP免疫组化染色。随机计数每张切片海马CA1区3个100倍视野的GABAARα1阳性细胞数及光密度值,以3张切片的平均数作为每只大鼠海马内GABAARα1阳性细胞个数及光密度值。9、统计学方法实验数据计量资料采用均数±标准差(X±s)表示,各组大鼠发作性阵挛的潜伏期比较、GAD65的蛋白表达量比较、GABA含量比较、GABAARα1的免疫阳性细胞数及光密度值的比较均用方差分析(one-way ANOVA检验),方差齐性时两组均数之间的比较选用LSD-t检验,检验水准α=0.05；方差不齐时两组均数之间的比较选用Dunnett T3检验法(GABAARα1阳性细胞数)。惊厥率和死亡率的比较用卡方检验,X2值选用Pearson法检验。数据应用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。三、结果1、同病异治复方对PTZ急性致痫大鼠发作性阵挛潜伏期的影响六个处理组间的发作性阵挛潜伏期有统计学差异(F=5.145,P=0.001)。B、C、D、E、F组均能延长PTZ急性惊厥大鼠发作性阵挛潜伏期(P<0.05),但是C、D、E组与F组的发作性阵挛潜伏期相比无统计学差异。C、D、E组的发作性阵挛潜伏期在一定的剂量范围内呈现出量效关系。2、同病异治复方对PTZ急性惊厥大鼠皮层和海马脑电图的影响G组(即正常组)大鼠脑电图以α、β波,散在θ波即基础波为主,无明显节律。A组(模型组)大鼠阵发出现大量高幅尖波、棘波、棘慢复合波。B和E组大鼠痫性放电明显受到抑制,只见极少量棘波或尖波。C组大鼠出现较多尖波、棘波、棘慢复合波,但波幅较模型组低。D、F组可见散在棘波或尖波,波幅较低。3、同病异治复方对小鼠最大电休克(MES)模型的影响六个处理组之间的惊厥率有统计学差异(X2=24.000, P=0.000), B、C、D、E和F组均较A组的惊厥率低,B组的惊厥率最低,D、E组惊厥率较F组低。并且C、D、E组在一定剂量范围内呈现量效关系。4、同病异治复方对小鼠士的宁惊厥模型的影响六个处理组之间的惊厥率和死亡率有统计学差异(X2值分别为15.173和15.250,P值分别为0.010和0.009),B、D、E和F组小鼠的惊厥率和死亡率较A组低,C、D、E的惊厥率和死亡率在一定的剂量范围内呈现量效关系,其中E组的惊厥率和死亡率最低。5、Western blotting法测GAD65在海马的表达处理组间的GAD65蛋白表达量有统计学差异(F=6.409,P=0.001),B组海马GAD65的蛋白表达量较A组显著降低,两者比较有统计学差异(P<0.01)。C、D、E组GAD65的蛋白表达量均高于B组,与B组相比有统计学差异(P<0.05),但三组之间比较无统计学差异。6、高效液相测海马GABA含量五个处理组间的GABA含量有统计学差异(F=5.736,P=0.002)。B组海马GABA的含量较A组显著降低,两者比较有统计学差异(P<0.01)。C、D、E组GABA的含量均高于B组,与B组比较均有统计学差异(P<0.05),但三组之间比较无统计学差异。7、免疫组化GABAARα1结果GABAARα1免疫阳性细胞在海马CA1区主要表达细胞膜上,部分表达于细胞浆,阳性细胞胞体呈圆形,卵圆形,三角形等,有的细胞有一个或者多个突起。五个处理组间的GABAARα1免疫阳性细胞及光密度值有统计学差异(F值分别为4.563和2.961,P值分别为0.017和0.039)。与B组相比,A、C、E组的GABAARα1受体免疫阳性细胞平均数和光密度值均有统计学差异(P<0.05),而D组与B组的GABAARα1受体免疫阳性细胞平均数和光密度值则均无统计学差异(P>0.05)。E组GABAARα1受体免疫阳性细胞数和平均光密度值与C组相比,两组没有统计学差异(P>0.05)。四、结论1、柴胡疏肝汤及定痫丸对PTZ惊厥大鼠、MES惊厥小鼠、士的宁惊厥小鼠都具有显著的抗惊厥、抗癫痫作用。2、柴胡疏肝汤的抗癫痫作用通过对抑制性神经递质GABA以下传导通路而体现：(1)增加PTZ点燃大鼠海马区GAD65的蛋白表达量和GABA的合成；(2)增加PTZ点燃大鼠海马区GABAARα1的表达量和增强其活性。3、定痫丸的抗癫痫作用通过对抑制性神经递质GABA以下传导通路而体现：增加PTZ点燃大鼠海马区GAD65的蛋白表达量和GABA的合成。