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[目的]本文实验目的主要分三部分,一、建立骨骼肌钝挫伤模型,采用白藜芦醇(Res)干预治疗,检测Res对骨骼肌损伤后修复作用;二、探讨骨骼肌损伤后给予干细胞移植治疗后效果;三、采用自体骨髓间充质干细胞移植加白藜芦醇(BM-MSC+Res)方案干预骨骼肌损伤修复,探讨BM-MSC+Res在促进受损骨骼肌结构与功能康复中的作用与机制。[方法]1.Res治疗骨骼肌损伤:33只新西兰兔随机分为三组:正常组(N组,3只)、自然恢复组(NR组,15只)、白藜芦醇组(Res组,15只)。除N组外均采用钝性暴力法制造骨骼肌钝挫伤模型,损伤后NR组不予处理,Res组给予Res灌胃治疗(15mg/kg/d)。并于伤后1、3、7、14、21d处死动物。直视法及周径测量法观测骨骼肌钝挫伤后损伤局部变化状况,HE及Masson染色观察损伤局部骨骼肌组织病理变化,IHC及Western blot检测骨骼肌中碱性成纤维细胞生因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转移生长因子(TGF-β1)、1型胶原蛋白(COL-I)表达。2.自体成体干细胞移植治疗骨骼肌损伤:33只新西兰兔随机分为三组:正常组(N组,3只)、对照组(C组,15只)、BM-MSC移植组(BM-MSC组,15只)。除N组外均采用钝性暴力法制造骨骼肌钝挫伤模型,损伤后C组注入无细胞的低糖DMEM培养液,BM-MSC组在骨骼肌损伤后损伤部位注射自体BM-MSC进行治疗,后续实验同方法1,并对其细胞进行检测。3.自体成体干细胞移植治疗后肢骨骼肌损伤及白藜芦醇对其影响的实验研究:48只新西兰兔随机分为三组:正常组(N组,3只)、白藜芦醇组(Res组,15只)、骨髓间充质干细胞移植(BM-MSC组,15只)及干细胞移植后白藜芦醇辅助治疗组(BM-MSC+Res组,15只)。除N组外均采用钝性暴力法制造骨骼肌钝挫伤模型,Res组给予Res灌胃治疗,BM-MSC组在骨骼肌损伤后给予损伤部位注射自体间充质干细胞进行治疗,BM-MSC+Res组在损伤后给予自体BM-MSC移植同时给予Res灌胃治疗。后续实验同方法1,并辅以电镜及超声进行检测。[结果]1.Res治疗骨骼肌损伤:直视法:骨骼肌伤后12h达肿胀峰值,72h后损区域肿胀完全消退;HE染色:N组肌纤维多边形、形态规则、排列紧密,肌核均匀分布于肌膜下,无增生与固缩,肌膜完整;NR组及Res组与第1d可见血细胞渗出,第3d炎症细胞开始浸润至7d达峰值,伤后第21d肌纤维形态基本恢复正常,整体而言,Res组动物在炎症细胞浸润程度,修复时间上均优于NR组;Masson染色:正常肌细胞中胶原纤维极少,伤后渐增,第14d左右达峰值,Res组兔损伤区域胶原纤维含量低于NR组。IHC:bFGF、IGF-1蛋白在肌纤维胞浆内弥漫着色,bFGF、IGF-1蛋白吸光度值于伤后呈先升后降趋势,NR组与Res组均于7d达高峰,21d仍高于N组,且Res组bFGF、IGF-1蛋白吸光度值与损伤前7日高于NR组,损伤14d及以后低于NR组,差异具有统计学意义(P<0.05);TGF-β1、COL-I蛋白在肌纤维胞浆内弥漫着色,其蛋白吸光度值在损伤后亦呈先升后降趋势,且NR组与Res组均于伤后7d达高峰,整个损伤过程中NR组TGF-β1、COL-I蛋白吸光度值均高于Res组,差异具有统计学意义(P<0.05);Western Blot:相关因子表达结果与IHC数据结果平行。2.自体成体干细胞移植治疗骨骼肌损伤:流式细胞鉴定显示:兔骨髓间充质干细胞CD90呈阳性,CD45呈阴性;直视法:损伤区肿胀,12h至肿胀值,72h后肿胀消退至实验前状态;HE染色:C组与BM-MSC组于损伤后1d均可见血细胞渗出,第3d炎症细胞开始浸润至7d达峰值,伤后第21d肌纤维形态基本恢复正常。Masson染色显示:正常肌细胞中胶原纤维含量极少,损伤随着瘢痕组织的形成,胶原纤维逐渐增加,于7-14d达高峰,BM-MSC组胶原纤维含量低于C组;IHC显示:bFGF、IGF-1蛋白含量于伤后呈先升后降趋势,两组均于7d达高峰,损伤前7d,BM-MSC-组蛋白含量高于C组,损伤I4d及其后,BM-MSC组蛋白含量低于C组,但损伤21d时,BM-MSC组及C组,仍高于正常,差别具有统计学意义(P<0.05);TGF-β1、COL-I其蛋白含量在损伤后呈现先升后降趋势,C组和BM-MSC组均于7d达高峰,C组在损伤整个过程中均高于BM-MSC组,差异具有统计学意义(P<0.05);Western Blot 显示:bFGF、IGF-I、TGF-β1和COL-I蛋白含量变化与IHC实验数据相平行。3.自体成体干细胞移植治疗后肢骨骼肌损伤及白藜芦醇对其影响的实验研究:直视法:损伤区肿胀,12h至肿胀峰值,72h后肿胀消退至实验前状态。超声示:骨骼肌损伤后其弹性降低,给予Res和BM-MSC治疗后弹性明显好转,但弱于BM-MSC+Res组表现。电镜结果显示:骨骼肌钝挫伤导致Z线水纹状或断裂、肌浆网肿胀或空泡化,肌膜下线粒体聚积且大小不一,肌纤维内线粒体肿胀、嵴稀少。骨骼肌钝挫伤后对其进行白藜芦醇干预治疗、骨髓间充质干细胞移植治疗、骨髓间充质干细胞移植后辅以白藜芦醇治疗等不同治疗方式,结果显示骨骼肌Z线、线粒体等超微结构异常变化程度均显著减轻,;HE显示:正常组兔肌纤维多边形、形态规则、排列紧密,肌核均匀分布于肌膜下,无增生与固缩,肌膜完整。各模型组伤后1d均可见血细胞渗出,伤后3d炎症细胞浸润,伤后7d炎症细胞逐渐减少,伴瘢痕组织形成,伤后21d肌纤维形态基本恢复正常;Masson染色显示:正常肌细胞中胶原纤维含量较少,伤后渐加,于7-14d达峰值,损伤整个过程中,BM-MSC+Res组胶原纤维含量均低于BM-MSC组和Res组,差异具有统计学意义(P<0.05)。IHC显示:bFGF、IGF-1蛋白均存于胞浆内,bFGF、IGF-1蛋白含量于伤后呈先升后降趋势,除正常组外均于7d达高峰。伤后前7d,BM-MSC+Res组bFGF蛋白含量高于BM-MSC组和Res组,但差异不具有统计学意义(P>0.05),损伤3-7d,BM-MSC+Res组IGF-1蛋白含量高于BM-MSC组和Res组,差异具有统计学意义(P<0.01);伤后14d,BM-MSC+Res组bFGF蛋白含量低于BM-MSC组和Res组,差异具有统计学意义(P<0.01),损伤后21d时各模型组均恢复正常;BM-MSC组和Res组IGF-1蛋白含量于损伤后21d时仍高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05),BM-MSC+Res组较正常组相比差异不具有统计学意义。TGF-β1、COL-I蛋白含量在损伤后呈现先升后降趋势,各模型组均于损伤后7d达高峰,TGF-β1蛋白与3、7d时BM-MSC+Res组蛋白含量低于BM-MSC组和Res组,差异具有统计学意义(P<0.01),整个损伤过程中,BM-MSC+Res-组-COL-I蛋白含量低于BM-MSC组和Res组,差异具有统计学意义(P<0.05);Western Blot 显示:bFGF、IGF-1、TGF-β1 和 COL-I蛋白含量变化与IHC实验数据相平行。[结 论]1.Res治疗骨骼肌损伤:白藜芦醇通过上调和下调bFGF、IGF-1蛋白表达,抑制TGF-β1、COL-I蛋白过表达达到促进骨骼肌损伤修复之目的。2.自体成体干细胞移植治疗骨骼肌损伤:自体骨髓间充质干细胞移植可通过上调和下调bFGF、IGF-1蛋白表达,抑制TGF-β1、COL-I蛋白过表达,进而促进骨骼肌损伤后修复。3.自体成体干细胞移植治疗后肢骨骼肌损伤及白藜芦醇对其影响的实验研究:自体骨髓间充质干细胞移植后给予白藜芦醇辅助治疗可通过上调和下调bFGF、IGF-1蛋白表达,抑制TGF-β1、COL-I蛋白过表达,进而促进骨骼肌损伤后修复。