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目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）毒力因子cag致病岛（cag PAI）编码Ⅳ型分泌系统（T4SS）以及效应蛋白Cag A。Cag A作为细菌中发现的唯一癌蛋白,通过T4SS进入胃上皮细胞引起炎症反应并释放大量炎症因子以及影响正常代谢导致感染患者病变发生。然而在不同环境条件下,cag PAI基因表达量可能具有明显差异,因而寻找可能的调控cag PAI基因表达机制,有助于理解Hp致病机制为临床治疗提供新思路。Hp含16种转录调控蛋白,包括Rpo D、Rpo N、Fli A、Hrc A、Ars R、HP0222、HP0564、Flg R、Hup、HP1021、Hsp R、Fur、Hsr A、Che Y、Nik R、Crd R,本课题组团队对这16个调控蛋白的调控作用及其机制开展了系列研究,本项目对其中HP0564、Hup、Fli A、Hsp R、Che Y的5种调控蛋白进行研究。首先克隆表达纯化该5种调控蛋白,而后通过EMSA实验筛选与cag A基因启动子和T4SS启动子结合的调控蛋白,在此基础上,进一步研究该转录调控蛋白对cag PAI的Cag A以及T4SS表达的影响。方法:1.调控蛋白HP0564、Hup、Hsp R、Che Y、Fli A的表达纯化1.1表达质粒“p AKS-IBA7plus-调控蛋白”构建以NCTC26695基因组为模板,PCR扩增获得hp0564、hup、hsp R、che Y、fli A片段。将片段分别连接于载体p ASK-IBA7plus,重组子转化至宿主菌BL21,涂布培养于含有氨苄西林BL平板上,转化子通过琼脂糖凝胶电泳和测序验证。1.2调控蛋白诱导表达及纯化将带有表达质粒的BL21,加入四环素诱导表达“Strep-HP0564”、“Strep-Hup”、“Strep-Hsp R”、“Strep-Che Y”和“Strep-Fli A”,使用超声裂解并用Strep-Tacti柱进行纯化。纯化后的诱导蛋白通过SDS-PAGE验证2.结合cag PAI中cag A和T4SS重要基因启动子的调控蛋白筛查2.1结合cag A启动子的调控蛋白筛查使用带有Alexa fluor 700荧光基团引物,PCR扩增cag A启动子片段并纯化后作为探针,分别用0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM五个不同浓度的Strep-HP0564、Strep-Hup、Strep-Hsp R、Strep-Che Y、Strep-Fli A共孵育后进行电泳迁移率实验（EMSA）,观察阻滞条带。2.2.HP0564与T4SS启动子结合将T4SS重要基因的启动子“promoter-cag1”、“promoter-cag U”、“promoter-cag Z”、“promoter-cag L”、“promoter-cag X”作为探针,分别用0μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM五个不同浓度的“Strep-HP0564”进行EMSA实验。3.通过BLAST分析调控蛋白HP0564的同源蛋白将NCTC26695中调控蛋白HP0564氨基酸序列导入NCBI在线蛋白BLAST网页（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）,选择标准数据库,物种中排除“helicobacter group（taxid:72293）”,优化中选择“PSI-BLAST”,进行BLAST分析。4.NCTC26695 hp0564基因突变株NCTC26695△hp0564构建4.1重组质粒“p Bluescript-hp0564”构建以NCTC26695基因组为模板,使用相关引物进行高保真PCR,获得hp0564上游、下游臂片段、同理获得kana R片段。通过Clon Express技术将产物片段与线性化“p Bluescript SK II（-）”质粒连接并转化入DH5ɑ,提取质粒,使用琼脂糖凝胶电泳和一代测序进行验证。4.2 hp0564基因被卡那霉素抗性基因代替使用同源重组原理,将“p Bluescript-hp0564”重组质粒电击转化至NCTC26695,液体培养过夜后,离心取下层沉淀,涂布至含有卡那霉素血平板中。转化子提取基因组后PCR进行验证。5.调控蛋白HP0564对cag PAI编码基因表达的调控作用5.1调控蛋白HP0564对Cag A表达调控液态培养Hp NCTC26695和NCTC26695Δhp0564,用q PCR检测Cag A的m RNA表达水平;Western blot检测蛋白表达水平。5.2调控蛋白HP0564对T4SS表达调控液态培养Hp NCTC26695和NCTC26695Δhp0564,使用q PCR检测cag PAI上T4SS全部操纵子中第一位基因cag1、cag C、cag F、cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag V表达。6.调控蛋白HP0564对Hp感染AGS细胞后cag PAI编码基因表达的调控作用6.1调控蛋白HP0564对Hp感染AGS细胞后Cag A表达调控实验分为3组:AGS组、AGS+NCTC26695组、AGS+NCTC26695Δhp0564组,提取RNA,q PCR检测Cag A m RNA水平的表达;提取蛋白,用Western blot检测Cag A和磷酸化Cag A蛋白表达。6.2 NCTC26695△hp0564对Hp感染AGS细胞后T4SS表达调控实验分为3组:AGS组、AGS+NCTC26695组、AGS+NCTC26695Δhp0564组,使用q PCR检测T4SS基因cag1、cag C、cag F、cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag V m RNA水平表达。结果:1.调控蛋白HP0564、Hup、Hsp R、Che Y、Fli A的表达纯化琼脂糖凝胶电泳结果显示,扩增产物大小与目的片段大小一致并且一代测序确认无突变位点,确认成功构建表达质粒“p ASK-hsp R”、“p ASK-che Y”、“p ASK-fli A”、“p ASK-hup”、“p ASK-hp0564”。表达纯化的蛋白,经SDS-PAGE检测,全部与预测大小一致,获得“Strep-HP0564”、“Strep-Hup”、“Strep-Che Y”、“Strep-Fli A”、“Strep-Hsp R”重组蛋白。2.结合cag A和T4SS重要基因启动子的调控蛋白筛查2.1结合cag A启动子的调控蛋白筛查EMSA结果显示:调控蛋白Fli A、Che Y、Hsp R不直接与cag A启动子结合;调控蛋白Hup和HP0564具有结合cag A启动子片段能力;具有调控作用的两个蛋白,Hup功能为已知,而HP0564功能尚未清楚。因此选择调控蛋白HP0564作为研究对象。2.2.调控蛋白HP0564与T4SS重要基因启动子结合“promoter-cag1”、“promoter-cag U”、“promoter-cag Z”、“promoter-cag X”、“promoter-cag L”五组EMSA实验中,调控蛋白HP0564均能与之结合。3.通过BLAST分析调控蛋白HP0564的同源蛋白根据BLAST结果:幽门螺杆菌的调控蛋白HP0564仅与hypothetical protein（Campylobacter cuniculorum）、Pg NI＿09985（Pyricularia grisea）、BHV94＿05910（Clostridiales bacterium）、TPA（Desulfurococcaceae archaeon）在氨基酸序列相似的E value分别为0.5、4.1、8、8.7。说明在其他属中并未存在调控蛋白HP0564类似蛋白。4.NCTC26695△hp0564构建成功构建重组质粒“p Bluescript-hp0564”电转至NCTC26695,琼脂糖电泳验证显示与目的条带位置一致。说明NCTC26695△hp0564的hp0564基因被kana R替代,获得NCTC26695△hp0564菌株。5.调控蛋白HP0564对cag PAI编码基因表达的调控作用5.1调控蛋白HP0564对Cag A表达调控q PCR检测的m RNA水平表达,结果显示NCTC26695△hp0564中Cag A表达高于NCTC26695（P<0.05）。同时通过Western Blot检测蛋白水平表达,结果显示NCTC26695△hp0564中Cag A表达也高于NCTC26695（P<0.05）。说明调控蛋白HP0564可以抑制Cag A表达。5.2调控蛋白HP0564对T4SS表达调控与NCTC26695相比,NCTC26695△hp0564 T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag V基因表达下调具有统计学意义（P<0.05）;cag1、cag C、cag F基因在两者中差异并无统计学意义。调控蛋白HP0564促进T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag1、cag C、cag V基因表达。6.调控蛋白HP0564对Hp感染AGS细胞后cag PAI表达调控6.1调控蛋白HP0564在Hp感染AGS细胞后对Cag A表达调控与AGS+NCTC26695组相比,AGS+NCTC26695△hp0564组Cag A在m RNA水平表达明显增高（P<0.05）;Western Blot检测结果显示:与AGS+NCTC26695组相比,AGS+NCTC26695△hp0564组Cag A以及磷酸化Cag A表达明显增高（均为P<0.05）,表明在Hp感染AGS过程中,调控蛋白HP0564抑制Cag A表达。6.2调控蛋白HP0564在Hp感染AGS细胞后对T4SS表达调控与AGS+NCTC26695组相比,AGS+NCTC26695△hp0564组T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag1、cag C、cag V基因表达下调具有统计学意义（P<0.05）;cag F基因在两组中并无统计学差异。提示在Hp感染AGS过程中,调控蛋白HP0564促进T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag1、cag C、cag V基因表达。结论:1.幽门螺杆菌调控蛋白HP0564可与cag A和T4SS重要基因启动子promoter-cag1、promoter-cag U、promoter-cag Z、promoter-cag X、promoter-cag L结合。2.调控蛋白HP0564抑制幽门螺杆菌Cag A蛋白的表达,促进T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag V基因表达。3.调控蛋白HP0564抑制幽门螺杆菌感染AGS后Cag A以及磷酸化Cag A的表达,促进T4SS中cag M、cag P、cag Q、cag S、cag U、cag1、cag C、cag V基因表达。