论文部分内容阅读
目的：A族链球菌（Group A streptococcus, GAS）是一种以人类为唯一宿主的细菌，感染后若治疗不及时可引发多种严重的疾病。本室在GAS致炎机制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究显示M蛋白有着较强的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬细胞的吞噬。结合本室前期工作，本课题对M蛋白在诱导及调节巨噬细胞活化方面做继续研究。巨噬细胞是机体重要的效应细胞，活化的巨噬细胞可以分泌促炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等，这些因子在诱导炎症反应、抗感染免疫中发挥着重要作用。炎症的发展过程中受许多负调控因子的作用，我们对肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（A20）予以了特别的关注，A20是炎症信号传导的中心--转录因子NF-κB的抑制因子，而M蛋白对A20的诱导产生，发挥作用有着怎样的影响？同时IL-10是一种强烈的抑制单核巨噬细胞分泌炎症因子的细胞因子，在巨噬细胞受到M蛋白刺激时它的表达情况如何？细胞因子信号转导抑制子（SOCS）是细胞信号JAK/STAT通路以及MYD88/NF-κB通路的负调控因子，在M蛋白所致巨噬细胞炎症发展过程中它的表达量如何？对于以上疑问，本课题旨在做初步研究。因此，在本研究中我们首先表达了M蛋白，同时构建并表达另一种由GAS分泌的蛋白SpeB作为对照蛋白，通过对比两种蛋白分别刺激巨噬细胞后的促炎细胞因子及相关负调控因子的表达情况来验证M蛋白是否与其他GAS相关蛋白在促进炎症以及表达负调控因子方面是否存在差异，以期为今后在M蛋白诱导巨噬细胞负调控因子表达方面更深入的研究奠定基础。通过以上工作，旨在深化对于GAS的认识，以期为临床更精确的靶向治疗提供实验依据。方法：1目的蛋白制备:将本室已有的含有M蛋白表达质粒pEGX2-T的贮存菌DH-5α提取质粒并转染表达菌E.coli BL21，用IPTG诱导表达M蛋白，经SDS-PAGE鉴定后，纯化，定量。构建SpeB蛋白的表达质粒pET28a-SpeB，转染表达菌E.coli BL21后表达蛋白，纯化，定量。2细胞毒性试验以及蛋白作用浓度的选择：首先MTT法检测M蛋白和SpeB蛋白的细胞毒性，鲎试剂盒检测融合蛋白LPS含量，然后参考以0.1、1、5、10μg/ml浓度的M蛋白作用于巨噬细胞RAW264.7后A20的表达情况，以确定适合刺激浓度。3以PBS为阴性对照，以LPS为阳性对照(用量10ng/μl)，M蛋白和SpeB蛋白分别刺激RAW264.7细胞后细胞因子的表达：以10μg/ml浓度的M蛋白和SpeB蛋白分别刺激RAW264.7细胞2、4、8、12小时后行Realtime-PCR检测细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及负调控因子A20、IL-10、SOCS1和SOCS3的mRNA表达水平。4M蛋白刺激RAW264.7细胞后A20、P65及TRAF6的表达：以10μg/ml浓度的M蛋白刺激RAW264.7细胞4、8、12、24小时后Western blot检测P65，A20及其下游分子TRAF6。5M蛋白刺激C57小鼠BMDM细胞后A20、P65及TRAF6的表达：以10μg/ml浓度的M蛋白刺激小鼠BMDM细胞4、8、12、24小时后Western blot检测P65，A20及其下游分子TRAF6。结果：1表达并纯化M蛋白，蛋白定量浓度为160μg/ml。构建、表达、并纯化SpeB蛋白，蛋白定量75μg/ml。2经MTT检测显示M蛋白浓度小于20μg/ml的时候对细胞无毒性,LPS含量为1.015ng/μl；SpeB蛋白小于16μg/ml的时候对细胞无毒性，LPS含量为0.786ng/μl。确定以10μg/ml作为蛋白作用浓度。3M蛋白刺激RAW264.7细胞2、4、8、12小时后行Realtime-PCR检测结果显示TNF-α、IL-1β、IL-6各细胞因子较对照均表达增高，多个时间点有显著性差异（P<0.05）。其中IL-1β和IL-6较TNF-α增高明显，在8小时左右达峰值。负调控因子方面A20表达增高明显，在4小时左右达到高峰，与对照相比，除4小时外皆有显著性差异（P<0.05）。 IL-10、SOCS1和SOCS3均有不同程度增高。同时用SpeB蛋白做平行实验，结果显示TNF-α、IL-1β、IL-6各细胞因子较对照均表达增高，但相对低于M蛋白刺激后的结果，而负调控因子A20、SOCS1和SOCS3的表达显著低于M蛋白刺激后的结果，IL-10的表达更是低于正常对照。4M蛋白刺激RAW264.7细胞4、8、12、24小时后经Western blot检测显示A20表达量在12小时以前呈逐渐增高，24小时A20的表达与12小时比较是降低的。M蛋白刺激RAW264.7细胞4、8、12、24小时后行Western blot检测P65和TRAF6结果显示P65表达增高明显且在24小时以内持续增高，表明NF-κB通路处于被激活的状态，而TRAF6的表达量在24小时内呈动态变化，即8小时和24小时的变化量要分别低于4小时和12小时。5M蛋白相同条件刺激BMDM细胞4、8、12、24小时行Western blot检测A20结果显示A20在12小时以内的表达量逐渐增高，24小时后的表达量低于12小时；P65的表达在24小时内是逐渐增高的而TRAF6的变化趋势与RAW264.7细胞相同。结论：1M蛋白和SpeB蛋白均能促进巨噬细胞分泌促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α，但M蛋白的致炎能力要明显强于SpeB蛋白，同时在刺激负反馈因子表达方面M蛋白也是要高于SpeB蛋白。2M蛋白可能通过NF-κB途径来激活细胞，也可以通过一定的途径激活负调节因子A20。3负调控因子A20可以通过作用于NF-κB炎症通路上的底物分子TRAF6使之降解从而起到一定的抑制炎症的作用。