【摘 要】
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苦皮藤作为重要的药用植物,其次级代谢产物苦皮藤素V是使用较为广泛的绿色农药。本课题组在分析苦皮藤素V的合成路径时,推测其骨架合成关键酶为桉叶烷型倍半萜合成酶,因此本课题以苦皮藤根部转录组数据中筛选出的倍半萜合成酶基因Ca TPS1为研究对象,对其进行了研究,具体内容如下:通过生物信息学分析可知Ca TPS1基因的开放阅读框全长1662 bp,编码553个氨基酸,且含有Rx R、DDxx D和NSE
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苦皮藤作为重要的药用植物,其次级代谢产物苦皮藤素V是使用较为广泛的绿色农药。本课题组在分析苦皮藤素V的合成路径时,推测其骨架合成关键酶为桉叶烷型倍半萜合成酶,因此本课题以苦皮藤根部转录组数据中筛选出的倍半萜合成酶基因Ca TPS1为研究对象,对其进行了研究,具体内容如下:通过生物信息学分析可知Ca TPS1基因的开放阅读框全长1662 bp,编码553个氨基酸,且含有Rx R、DDxx D和NSE/DTE保守序列,系统进化树分析将其聚类到TPS-a亚家族。近缘物种雷公藤来源的Tw TPS12基因与Ca TPS1基因有高度同源性,因此本实验将两者构建到同一表达体系中,得到重组菌株WQ011p RS426-Ca TPS1和WQ011 p RS426-Tw TPS12,使用GC-MS检测发酵产物,确认Ca TPS1为桉叶烷型倍半萜合成酶,其主产物为β-桉叶醇,产量为0.697 mg/L,Tw TPS12也是桉叶烷型倍半萜合成酶,其主产物为α-桉叶醇,产量为0.602mg/L。本课题构建了原核表达载体p ET28a-Ca TPS1并导入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达,经SDS-PAGE分析,确定最优诱导条件为0.2 m M IPTG 16?C低温诱导24 h。使用纯化出的Ca TPS1蛋白进行体外酶促反应,分析其酶学性质,结果显示最适反应时间为60 min,且在28?C、p H 6.4下酶活力最高,酶促动力学常数Km为6.26±0.25μM,Kcat为（1.764±0.014）×10-3s-1。本课题使用同源模建技术构建了Ca TPS1-FPF-(Mg2+)3和Tw TPS12-FPF-(Mg2+)3复合物的结构模型,确认了构成蛋白质疏水口袋的氨基酸,并选择Ca TPS1的TRP276、ILE300、TYR379和ASP448进行定点突变,得到四株突变菌株WQ011 p RS426-Ca TPS1 W276Y,WQ011 p RS426-Ca TPS1 I300G,WQ011p RS426-Ca TPS1 Y379F和WQ011 p RS426-Ca TPS1 D448E,突变菌株的产物种类均有变化。分析结果显示,TRP276对Ca TPS1疏水口袋的形态有支撑作用,ILE300是导致Ca TPS1与Tw TPS12产物双键位置不同的原因之一,TYR379参与到质子转移的反应体系当中,而ASP448使Ca TPS1能够正确结合金属离子。本课题从功能和结构两方面初步探究了苦皮藤来源的Ca TPS1的催化机制,并分析了其酶学性质,为未来研究苦皮藤素V的合成机制提供了理论依据。
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