【摘 要】
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Xp11.2易位性肾癌（Xp11.2 tRCC）是一种与基因融合相关的罕见肾癌亚型。野生型TFE3是一种转录因子,染色体重排时X染色体短臂1区1带2亚带的TFE3基因与伙伴基因（如位于X染色体长臂1区3带1亚带的NONO）融合并获得其强启动子,进而高表达转录活性的融合蛋白。有研究显示Xp11.2 tRCC中（包括NONO-TFE3 tRCC）存在融合蛋白上调MET转录进而促进肿瘤增殖的情况。MET
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Xp11.2易位性肾癌（Xp11.2 tRCC）是一种与基因融合相关的罕见肾癌亚型。野生型TFE3是一种转录因子,染色体重排时X染色体短臂1区1带2亚带的TFE3基因与伙伴基因（如位于X染色体长臂1区3带1亚带的NONO）融合并获得其强启动子,进而高表达转录活性的融合蛋白。有研究显示Xp11.2 tRCC中（包括NONO-TFE3 tRCC）存在融合蛋白上调MET转录进而促进肿瘤增殖的情况。MET基因的转录上调可能导致相关circRNAs的失调,而许多circRNAs参与了各类肿瘤的发病。穿心莲是一味清热解毒的中药,有研究表明穿心莲内酯能够影响包括MET在内的多条通路抑制肿瘤细胞增殖。本论文围绕NONO-TFE3 tRCC中MET基因潜在失调的circRNAs展开研究,并在体外细胞实验中观察了穿心莲内酯抑制肿瘤增殖的效果。目的:1.探索NONO-TFE3 tRCC中MET基因潜在失调的circRNAs及对肿瘤增殖的影响,进一步明确其作用机制。2.细胞实验观察穿心莲内酯处理后NONO-TFE3tRCC增殖所受影响。方法:1.qPCR检测比较NONO-TFE3 tRCC及其他组织切片中MET所转录的circRNAs水平,Western blot检测MET蛋白水平;2.通过PCR扩增、RNase R处理等验证circMET生物学特性;改变circMET水平后qPCR分析对MET mRNA水平影响,通过集落形成等功能实验评估对肿瘤增殖的影响;3.敲低/过表达改变NONO-TFE3水平后qPCR检测circMET水平所受影响。4.筛选circMET潜在靶miRNAs,改变miR-1197或circMET水平后通过RNA pull-down、AG02-RIP实验及qPCR检测circMET与miR-1197结合的能力,并在双荧光素酶报告基因实验中验证;5.改变circMET水平,qPCR检测circMET对于miR-1197水平的影响,设计挽救实验观察circMET能否通过调节miR-1197对肿瘤增殖构成影响;6.不同浓度心莲内酯处理UOK109等细胞24h后cck-8比色法检测细胞增殖活力;7.延长干预时间或同时改变UOK109细胞TFE3/circMET/miR-1197水平并检测细胞活力变化。结果:1.MET 及 circ-0082002（circMET）在NONO-TFE3 tRCC 中高表达;2.CircMET在细胞质中富集,对核酸外切酶不敏感,较线性MET更为稳定;可使用发散引物在cDNA中进行扩增;3.调节circMET不影响亲本基因mRNA水平,高表达的circMET可促进肿瘤增殖;4.NONO-TFE3 tRCC中融合蛋白上调了 circMET水平;5.CircMET通过吸附并降解miR-1197促进肿瘤增殖;6.UOK109细胞对穿心莲内酯敏感程度低,但细胞活力在延长干预时间至48h或同时改变TFE3/circMET/miR-1197水平后明显下降。结论:1.NONO-TFE3 tRCC中融合蛋白能够上调circMET;高表达的circMET在胞质中吸附并降解miR-1197,促进肿瘤增殖。敲减TFE3/circMET或过表达miR-1197可在一定程度上抑制UOK109细胞增殖。2.穿心莲内酯能够以浓度、时间依赖的方式在一定程度上抑制UOK109细胞增殖,但CC50较高,此浓度对非肿瘤细胞生长具有一定的毒性。延长干预时间或改变TFE3/circMET/miR-1197水平可提升UOK109对穿心莲内酯的敏感性。
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