肝癌是全球癌症相关死亡率的第三大常见原因,我国是肝癌大国,肝癌患者占全世界的一半以上,80%是由乙肝引起的。甲胎蛋白（Alphafetoprotein,AFP）是近几十年来应用最广泛的肝癌生物标志物,但其检测灵敏度和特异性较低。因此,研究者们一直在寻找更好的肝癌生物标志物。研究发现,由乙肝引起的肝癌患者血清中高尔基体蛋白73（Golgi protein 73,GP73）的水平明显高于正常人和其他疾病患者,并且用GP73蛋白作为生物标志物检测乙肝相关性肝癌的灵敏度和特异性均较高。因此,GP73可能是一个比AFP更好的诊断乙肝相关性肝癌的标志物。本研究旨在制备一种高特异性的GP73抗体,用于建立检测肝癌细胞分泌的GP73的方法,同时对编码该抗体可变区的基因进行分析。本研究中,我们分别构建原核表达载体pET-32a-SUMO-GP73和pGEX-6P-1-GP73,确定重组蛋白的最佳诱导表达条件并亲和纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备、鉴定抗GP73的单克隆抗体;然后克隆抗GP73的单克隆抗体可变区序列,通过IG Blast和Vbase2等生物信息学软件分析抗体可变区序列。主要研究方法和实验结果如下:1.GP73载体构建及重组表达我们将GP73基因克隆至pET-32a-SUMO和pGEX-6P-1载体中,将重组质粒转化至BL21（DE3）大肠杆菌。通过优化表达条件,确定His-SUMO-GP73的最佳表达条件为0.2 mM IPTG、20℃诱导4 h,GST-GP73的最佳表达条件为0.2 mM IPTG、25℃诱导4 h。重组蛋白经亲和层析进行分离纯化后能得到较高纯度的融合蛋白。2.GP73单克隆抗体的制备与鉴定以His-SUMO-GP73蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后,利用ELISA方法检测小鼠体内抗体水平,选择抗体滴度最高的小鼠,分离脾细胞,进行细胞融合,通过筛选获得5株能够稳定分泌抗GP73的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A12、2F12、3B10、3G2、4G9,其中1A12和3G2的亚型为IgM,2F12和4G9的亚型为IgG1,3B10亚型不单一。Western Blot结果表明抗体具有较高的特异性。最后,从能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA并反转录为cDNA,从cDNA中克隆抗GP73的单克隆抗体可变区序列,通过IG Blast和Vbase2等生物信息学软件对抗体可变区序列进行分析。结果显示扩增的VH和VL序列为小鼠抗体可变区序列,各包含3个CDR区和4个FR区。同时,利用分子对接初步确单克隆抗体识别GP73蛋白抗原的关键氨基酸残基。综上所述,我们成功的制备出5株能稳定分泌GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中2F12和4G9为IgG1类抗体,且抗体特异性较高,可以为将来研发肝癌早期筛选试剂盒提供实验基础。另外,我们克隆出GP73单克隆抗体的可变区序列,可以解决杂交瘤细胞株易丢失染色体或抗体基因发生突变而失去应用价值的问题,为进一步构建具有高亲和力和生物学效应的抗人GP73基因工程抗体奠定基础。