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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上第五大最常见的癌症和第三大癌症死亡原因。肿瘤微环境与肿瘤进展密切相关,免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成。肝癌的免疫逃逸是肝癌进展的重要因素。外泌体是由各种类型的细胞分泌的直径约30-100nm的小脂双层膜囊泡,能够将各种细胞分泌的包括RNA,蛋白质和脂质在内的各种分子转运到目标细胞中,充当细胞间交流的信使。越来越多的证据表明,癌症来源的外泌体在肿瘤免疫逃逸中发挥重要的作用。研究表明,CD4+T细胞在肿瘤免疫逃逸中扮演关键角色,其中调节T细胞（Regulatory T cells,Tregs）是导致肝癌免疫抑制微环境的主要抑制性CD4+T细胞。叉头/翼螺旋转录因子（Fork head/winged helix transcription factor,FOXP3）是Tregs的特征性转录因子,主要参与调节Tregs的发育和维持Tregs的免疫抑制能力。越来越多的研究证实,通过调控CD4+T细胞FOXP3的表达能够诱导Tregs的分化水平,从而调控肿瘤的免疫反应。因此,本研究有必要探究HCC细胞来源的外泌体是否通过调控CD4+T细胞中FOXP3的表达诱导Tregs的分化,并揭示具体机制。本研究通过生信手段确定SHC4为目标蛋白,Src同源性和胶原蛋白4（Src homology and collagen 4,SHC4）是一种重要的细胞内衔接蛋白,已被证明在在肝细胞癌中高表达,并能够促进肝细胞癌的增殖和转移。本研究针对HCC细胞来源的外泌体释放的SHC4通过刺激FOXP3+CD4+T细胞促进肿瘤进展的机制展开了一系列的研究,旨在为肝癌的免疫治疗提供理论依据并为肝癌诊断提供潜在的新型标记物。方法:1.为了探究HCC细胞来源的外泌体对于HCC生长的影响中的作用,本研究提取并鉴定外泌体;利用免疫组化分析肝癌组织与癌旁组织中外泌体标记物（CD63）的差异;构建原位肝癌模型,将HCC来源外泌体经尾静脉注射,以PBS为对照,分析HCC来源外泌体对于肝癌生长的影响;为了进一步探究T细胞在介导HCC细胞来源的外泌体对于HCC细胞增殖、侵袭和迁移的影响中的作用,本研究构建肝癌细胞外泌体与CD4+T细胞的共培养体系,利用流式细胞术分析肝癌细胞外泌体及PBS与CD4+T细胞共培养后的FOXP3+CD4+T细胞的水平;将外泌体及PBS处理后的T细胞的条件培养基与肝癌细胞进行共培养,通过CCK-8实验分析肝癌细胞的增殖情况;将外泌体及PBS处理后的CD3+T细胞与肝癌细胞进行间接共培养,通过Transwell观察肝癌细胞的侵袭、迁移情况。2.为了探究HCC细胞来源的外泌体蛋白刺激的FOXP3+CD4+T细胞活化对于HCC细胞增殖、侵袭和迁移的影响,本研究利用GEO数据库筛结合qRT-PCR筛选外泌体中的目标蛋白;利用western blot探究5种肝癌细胞系来源的外泌体中目标蛋白的表达情况并进一步筛选目标细胞系用于后续机制分析;在CD4+T细胞中过表达SHC4,以空载质粒为对照,利用western blot探究外泌体SHC4对于CD4+T细胞中FOXP3表达的影响;将外泌体及PBS处理后的T细胞与肝癌细胞进行间接共培养,通过Transwell实验探究HCC细胞来源的外泌体SHC4刺激的FOXP3+CD4+T细胞活化对于HCC细胞侵袭和迁移能力的影响。3.为了探究HCC细胞来源的外泌体SHC4刺激FOXP3+CD4+T细胞活化的信号通路,本研究在CD4+T细胞中过表达SHC4,以空载质粒为对照,利用western blot探究外泌体SHC4对于CD4+T细胞中STAT3信号通路的影响;构建外泌体与CD4+T细胞的共培养体系,以PBS为对照,探究外泌体SHC4激活的STAT3信号通路对于FOXP3表达调控,流式细胞术检测外泌体SHC4激活的STAT3信号通路对于FOXP3+CD4+T细胞中FOXP3表达的影响。为了进一步探究STAT3信号通路介导的HCC细胞来源的外泌体SHC4刺激的FOXP3+CD4+T细胞活化对于HCC的体外侵袭、迁移及体内转移中的影响,本研究开展了Transwell实验、体内转移模型探究STAT3信号通路在介导HCC来源的外泌体SHC4处理的CD3+T细胞对于HCC侵袭和迁移情况的影响中的作用。实验结果:1.成功提取并鉴定HCC来源的外泌体,体内实验的结果首先表明HCC细胞来源的外泌体促进HCC的体内生长。进一步的流式细胞术结果表明外泌体处理后的CD4+T细胞中FOXP3的表达显著增高,并结合CCK-8、Transwell功能学实验结果证实HCC细胞来源的外泌体通过刺激FOXP3+CD4+T细胞活化而促进了HCC细胞的增殖、侵袭和迁移。2.本研究继续通过GEO数据库结合qRT-PCR筛选了外泌体目标蛋白SHC4,并利用western blot证实SHC4在HCC细胞来源的外泌体中显著高表达。随后在CD4+T细胞中过表达SHC4或将HCC细胞来源外泌体与CD4+T细胞进行共培养,通过western blot初步证实HCC细胞来源的外泌体SHC4刺激FOXP3+CD4+T细胞活化;结合进一步的Transwell功能学实验结果证实HCC细胞来源的外泌体SHC4通过刺激FOXP3+CD4+T细胞活化而促进HCC细胞的侵袭和迁移。3.Western blot的结果首先表明HCC细胞来源的外泌体的SHC4可通过STAT3信号通路诱导FOXP3的表达,此外,流式细胞术结果同样证实HCC细胞来源的外泌体SHC4通过STAT3信号通路诱导FOXP3+CD4+T细胞活化;基于上述机制所开展的体内外功能学实验结果则进一步揭示HCC细胞来源的外泌体SHC4通过STAT3信号通路刺激FOXP3+CD4+T细胞活化而促进HCC的体外侵袭、迁移及体内的转移。结论:1.HCC细胞来源的外泌体促进HCC的进展。2.HCC细胞来源的外泌体SHC4通过STAT3信号通路刺激FOXP3+CD4+T细胞活化,从而促进HCC的进展。