背景:视网膜水肿是引起非增殖期糖尿病视网膜病变患者视功能损害的一个主要原因。血-视网膜内屏障(i BRB)功能障碍以及表达于视网膜Müller细胞上的特殊蛋白水通道蛋白4(AQP4)与内向整流性钾通道4.1(Kir4.l)之间的失藕联是糖尿病视网膜水肿形成的重要病理机制;但目前中医药对糖尿病视网膜水肿作用机制的研究靶点大多在视网膜血管内皮细胞,至今未见从AQP4与Kir4.l之间的藕联关系以及i BRB损伤与保护机制等多角度研究中医药对糖尿病视网膜水肿有何干预作用的报道。目的:从i BRB损伤与保护机制、视网膜AQP4与Kir4.l之间的藕联关系等多个角度研究补肾活血法对早期糖尿病视网膜水肿形成有何干预作用及其相关途径,以期从多层次揭示补肾活血法防治DR的药物干预途径和可能的干预环节。方法:以高糖高脂膳食联合中等剂量STZ腹腔注射的方法诱导SD大鼠2型糖尿病模型,将造模成功后的糖尿病大鼠随机分为5组即阴性对照组、阳性对照组(羟苯磺酸钙干预组)、补肾活血中药复方高剂量组、补肾活血中药复方中剂量组、补肾活血中药复方低剂量组。正常对照组纳入的为未进行造模的同龄正常SD大鼠。各项指标检测的时间节点分别为糖尿病病程的第1周、2周、4周和8周。采用免疫组化法检测大鼠视网膜Occludin、ZO-1、AQP4、Kir4.1蛋白的分布;采用Western blot法检测大鼠视网膜Occludin、ZO-1、IL-1β、ICAM-1、VEGF、PEDF、AQP4、Kir14.1蛋白的表达水平;采用RT-PCR法检测大鼠视网膜AQP4m RNA、Kir4.1m RNA的表达水平;采用罗丹明(RHIC)检测大鼠血-视网膜屏障渗漏情况。结果:1、采用高糖高脂饲料喂养1周联合40mg/Kg STZ腹腔注射的方法诱导SD大鼠2型糖尿病动物模型,死亡率低、成模率较高。2、正常对照组大鼠在实验的各时期均未检测到视网膜RHIC渗漏;阴性对照组大鼠在糖尿病病程的第2、4、8周时于视网膜的NFL、GCL、IPL、INL和OPL观察到RHIC渗漏,且在OPL观察到的RHIC渗漏最显著,RHIC渗漏程度随着病程的延长逐渐加重。3、(1)正常对照组大鼠视网膜紧密连接相关蛋白ZO-1、0ccludin的表达量稳定。(2)阴性对照组大鼠视网膜紧密连接相关蛋白ZO-1、0ccludin的表达量从糖尿病病程的第1周开始就明显低于正常对照组(P<0.05),ZO-1比0ccludin降低更明显;0ccludin蛋白的表达量随时间延长逐渐降低。(3)ZO-1、0ccludin蛋白在羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜中的表达量明显高于阴性对照组(P<0.05)。(4)补肾活血中药复方各剂量组与同期羟苯磺酸钙组比较:1周时的中药中、高剂量组及4周时的中药高剂量组Occludin蛋白表达量均高于羟苯磺酸钙组(P<0.05),其余各时间点中药各剂量组与羟苯磺酸钙组比较Occludin蛋白表达量均无统计学差异(P>0.05)。1周时中药高、低剂量组和4周时中药低剂量组ZO-1蛋白的表达量低于羟苯磺酸钙组(P<0.05);4周时中药高剂量组和8周时中药中剂量组ZO-1蛋白的表达高于羟苯磺酸钙组(P<0.05);其余各时间点中药各剂量组与羟苯磺酸钙组比较ZO-1蛋白的表达量均无统计学差异(P>0.05)。4、(1)正常对照组大鼠视网膜炎症相关因子IL-1β、ICAM-1在实验的各时期表达量稳定。(2)IL-1β、ICAM-1蛋白在阴性对照组大鼠视网膜中的表达量明显较正常对照组高(P<0.05),IL-1β的表达量在第1周时就已经显著上升,ICAM-1的表达量呈现随时间延长逐渐增加的趋势。(3)IL-1β、ICAM-1蛋白在羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜中的表达量明显低于阴性对照组(P<0.05)。(4)补肾活血中药复方各剂量组与同期羟苯磺酸钙组比较:4周时中药高剂量组IL-1β蛋白的表达量低于期羟苯磺酸钙组(P<0.05);1周、4周、8周的中药低剂量组以及1周的中药高剂量组IL-1β蛋白的表达量高于期羟苯磺酸钙组(P<0.05);其余各时间点中药各剂量组与同期羟苯磺酸钙组比较,IL-1β蛋白的表达差异无无统计学意义(P>0.05)。1周时中药中剂量组ICAM-1蛋白的表达量明显低于羟苯磺酸钙组(P<0.05),4周时中药低剂量组以及8周时中药高剂量组ICAM-1蛋白的表达量高于羟苯磺酸钙组(P<0.05),其余各时间点中药各剂量组与羟苯磺酸钙组比较,ICAM-1蛋白的表达量无统计学差异(P>0.05)。5、(1)正常对照组大鼠在实验的各时期视网膜VEGF蛋白表达量稳定。(2)VEGF蛋白在阴性对照组大鼠视网膜中的表达量明显较正常对照组高(P<0.05)。VEGF蛋白在羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜中的表达量明显低于阴性对照组(P<0.05)。(4)补肾活血中药复方各剂量组与同期羟苯磺酸钙组比较:第1周中药各剂量组以及第2周中药中剂量组大鼠视网膜VEGF蛋白的表达量低于羟苯磺酸钙组(P<0.05);第2周中药高剂量组大鼠视网膜VEGF蛋白的表达量高于羟苯磺酸钙组(P<0.05);余各时期中药各剂量组VEGF蛋白的表达量与羟苯磺酸钙组比较差异无统计学意义(P>0.05)。6、(1)正常对照组大鼠在实验的各时期视网膜PEDF蛋白表达量稳定。(2)在糖尿病病程的第1周时,PEDF蛋白的表达量在阴性对照组与正常对照组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);在第2、4、8周时PEDF蛋白在阴性对照组大鼠视网膜中的表达量明显高于正常对照组高(P<0.05)。(3)在整个实验过程中,羟苯磺酸钙组大鼠视网膜PEDF蛋白表达量波动较小。(4)补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜PEDF蛋白的表达量在第1、2周时与正常对照组相当,在第4、8周时表达量明显增加,高于正常对照组(P<0.05)。(5)补肾活血中药复方各剂量组与同期羟苯磺酸钙组比较:在第1、2周时各组PEDF蛋白的表达量相当(P>0.05);第4周的中药中、高剂量组以及第8周的中药各剂量组PEDF蛋白的表达量均明显高于羟苯磺酸钙组(P<0.05)。7、VEGF、PEDF的平衡:(1)阴性对照组在1周时VEGF/PEDF比值增大,VEGF、PEDF的平衡被破坏;第2、4周时VEGF/PEDF比值趋近于正常对照组;第8周时VEGF/PEDF比值再次增加,VEGF、PEDF的平衡再次打破。(2)羟苯磺酸钙组在第1、2、4周VEGF/PEDF比值与正常对照组接近;在第8周时VEGF/PEDF比值增加,VEGF、PEDF的平衡被打破。(3)补肾活血中药复方各剂量组中除中药高剂量组在第2周时VEGF/PEDF比值明显增大,其余各中药组在各时期VEGF/PEDF比值与正常对照组接近,甚至低于正常对照组。8、(1)正常对照组大鼠在实验的各时期视网膜AQP4蛋白、AQP4 m RNA蛋白表达量稳定。(2)AQP4蛋白、AQP4 m RNA蛋白在阴性对照组大鼠视网膜中的表达量明显高于正常对照组(P<0.05),随着病程延长表达量逐渐增加。AQP4蛋白与AQP4 m RNA蛋白的表达趋势相近。(3)AQP4蛋白、AQP4 m RNA蛋白在羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜中的表达量明显低于阴性对照组(P<0.05)。9、(1)正常对照组大鼠在实验的各时期视网膜Kir4.1蛋白、Kir4.1m RNA蛋白表达量稳定。(2)阴性对照组大鼠视网膜在糖尿病病程的第1、2、4、8周Kir4.1蛋白、Kir4.1m RNA蛋白的表达明显低于同期的正常对照组(P<0.05)。Kir4.1蛋白、Kir4.1m RNA蛋白的表达趋势相近。(3)羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜Kir4.1蛋白的表达量在第1、2、周时与阴性对照组相当,在第4、8周时明显高于阴性对照组(P<0.05);Kir4.1m RNA蛋白在羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组大鼠视网膜中的表达量明显高于阴性对照组(P<0.05)。10、AQP4与Kir4.1的耦联:(1)阴性对照组在糖尿病病程的第1周时AQP4/KIR4.1比值较正常对照组明显增加,AQP4与KIR4.1的耦联被破坏;第2周时AQP4/KIR4.1比值下降但明显高于正常对照组;第4周、8周时AQP4/KIR4.1比值进一步增大。(2)羟苯磺酸钙组以及补肾活血中药复方各剂量组在第1周时AQP4/KIR4.1比值均较正常对照组增加但明显低于阴性对照组,AQP4与KIR4.1的耦联被破坏。第2周时AQP4/KIR4.1比值较第1周时下降但仍明显高于正常对照组。第4、8周时AQP4/KIR4.1比值增加并趋于平稳,明显低于阴性对照组。结论:1、高糖高脂膳食喂养1周联合中等剂量STZ(40mg/Kg)腹腔注射的方法可以成功地诱导SD大鼠2型糖尿病模型,并兼顾死亡率以及成模率在较好的水平。2、8周病程的2型糖尿病大鼠可以作为早期糖尿病视网膜水肿的动物模型。糖尿病大鼠视网膜Occludin和ZO-1的表达量随糖尿病病程的延长不断下降,在8周时尤为明显,提示8周糖尿病病程的大鼠视网膜血管内皮细胞间紧密连接(TJ)的结构基础已经发生病理性改变。TJ损伤是早期糖尿病大鼠视网膜罗丹明渗漏明显增加的主要原因、是早期糖尿病视网膜i BRB损伤的一个重要病理改变。补肾活血中药复方能明显提高早期糖尿病大鼠视网膜Occludin和ZO-1蛋白的表达量,可能是补肾活血中药复方能减轻早期糖尿病视网膜水肿的一个重要的作用机制。3、早期糖尿病大鼠视网膜IL-1β、ICAM-1蛋白的表达量明显升高,且IL-1β蛋白表达增加早于ICAM-1蛋白,提示IL-1β、ICAM-1等炎症因子可能是导致早期糖尿病大鼠视网膜i BRB损伤的重要原因。补肾活血中药复方能明显降低早期糖尿病大鼠视网膜IL-1β、ICAM-1等炎症因子的表达,可能是其保护早期糖尿病大鼠视网膜i BRB的一个重要干预途径。4、早期糖尿病大鼠视网膜VEGF、PEDF蛋白的表达量均高于正常对照组,且VEGF增加的时间早于PEDF,提示早期糖尿病大鼠视网膜PEDF的升高是一种“代偿性升高现象”,视网膜PEDF与VEGF动态平衡被打破可能是早期糖尿病视网膜水肿形成的一个重要原因。补肾活血中药复方干预能明显恢复早期糖尿病大鼠视网膜VEGF、PEDF的平衡,这可能是其保护早期糖尿病大鼠视网膜i BRB、减轻视网膜水肿的一个重要机制。5、早期糖尿病大鼠视网膜AQP4蛋白、AQP4 m RNA蛋白表达量随着病程的延长逐渐升高;Kir4.1蛋白、Kir4.1m RNA蛋白的表达量显著下降。在糖尿病病程1周时,大鼠视网膜AQP4与Kir4.l的动态平衡被打破,即AQP4与Kir4.1失耦联,并且随糖尿病病程的延长逐渐加重,从而导致水、K+转运功能异常,这可能是导致早期糖尿病视网膜水肿的一个重要原因。补肾活血中药干预能明显地抑制早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、AQP4 m RNA蛋白的上调以及Kir4.1、Kir4.1m RNA蛋白的下调,从转录水平调节AQP4与Kir4.1的表达,改善AQP4与Kir4.1的失耦联状态,这可能是补肾活血中药复方能减轻早期糖尿病视网膜水肿的一个重要作用机制。6、早期糖尿病大鼠视网膜IL-1β、ICAM-1、VEGF、AQP4等细胞因子表达升高;紧密连接相关蛋白Occludin、ZO-1以及Kir4.1表达下降;AQP4与Kir4.1失耦联以及VEGF与PEDF的平衡破坏可能均为早期糖尿病视网膜水肿的重要原因,即糖尿病大鼠视网膜i BRB损害可能是多种机制共同作用的结果。补肾活血中药复方减轻早期糖尿病视网膜水肿可能是通过多层次、多靶点的干预途径实现的。