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目的：心血管疾病的发病率和死亡率居世界首位，全世界每年大约有1700万人死于心血管疾病。心肌纤维化（myocardial fibrosis）是慢性心血管疾病的关键病理特征，心肌纤维化可引起心力衰竭、恶性心律失常和心源性猝死等，其严重程度和疾病的发展及预后密切相关。因此，研究心肌纤维化的发病机制、研发疗效理想的抗心肌纤维化药物，对于提高患者生存率、降低死亡率具有十分重要的意义。心肌纤维化是指各种原因导致的心肌间质心脏成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积。心脏成纤维细胞（cardiac fibroblast）异常增殖及过度合成和分泌大量胶原蛋白是心肌纤维化形成的细胞学本质。所以，研究心脏成纤维细胞的变化对于探索心肌纤维化的发生机理及防治有着非常重要的现实意义。心肌纤维化的发病机制复杂，目前确切的发病机制并不十分清楚，但细胞因子在其中的作用日益受到关注。如转化生长因子-β1（transforminggrowth factor-β1，TGF-β1）和结缔组织生长因子等。内皮素-1（endothelin-1，ET-1）是机体重要的细胞因子之一，能以自分泌和旁分泌方式调节局部血管紧张度，同时是一种长效、有力的促有丝分裂剂，可促进细胞增殖，从而可能在心肌纤维化的发生发展过程中起作用。近年来研究显示，醛固酮（aldosterone，Ald）在心肌纤维化中亦有重要的作用。因此，本实验探讨ET-1在Ald诱导的心肌纤维化中的作用。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可特异沉寂目的基因从而调节目的蛋白表达，具有高效、特异和低毒的特点。近年来，siRNA技术迅速发展为研究基因功能、疾病机制和疾病防治等领域的重要工具。Shyu等人在离体心肌纤维化模型中利用siRNA，发现Urotensin II是缺氧状态下血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）诱导心脏成纤维细胞心肌纤维化的一个重要介质。同时有研究表明在持续肺动脉高压模型的肺动脉内皮细胞，给予ET-1siRNA处理后能增加管腔形成，并降低Rho激酶活性。上述的研究为ET-1siRNA在心肌纤维化模型心脏成纤维细胞中的应用奠定了一定的实验基础。因此，本实验在Ald诱导的心肌纤维化细胞模型中应用ET-1siRNA转染心脏成纤维细胞，以探讨ET-1在Ald诱导的心肌纤维化中的作用，为临床上心肌纤维化的发病机制和防治研究提供新的线索和依据。实验分组及方法：1大鼠心脏成纤维细胞siRNA的转染效率和持续时间应用LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和绿色荧光素标记的不同浓度的siRNA转染心脏成纤维细胞，观察细胞的转染效率和转染持续时间，以确定最佳的siRNA转染浓度和时间，为下一步ET-1siRNA的转染提供实验依据。无菌条件下开胸剪取SD大鼠心室，用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得心脏成纤维细胞。试验采用3-4代心脏成纤维细胞，随机分为以下6组：（1）空白对照组（n=6）：细胞仅加入培养基Opti-MEM I。（2）LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂组（n=6）：细胞加入培养基Opti-MEM I和LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂。（3）12.5nmol/L siRNA转染组（n=6）：细胞加入培养基Opti-MEM I，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和绿色荧光素标记的siRNA（Block-iT）12.5nmol/L。（4）25nmol/L siRNA转染组（n=6）：细胞加入培养基Opti-MEM I，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和绿色荧光素标记的siRNA25nmol/L。（5）50nmol/L siRNA转染组（n=6）：细胞加入培养基Opti-MEM I，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和绿色荧光素标记的siRNA50nmol/L。（6）100nmol/L siRNA转染组（n=6）：细胞加入培养基Opti-MEM I，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和绿色荧光素标记的siRNA100nmol/L。在荧光倒置显微镜下进行明场和荧光对照观察不同siRNA转染浓度（12.5nmol/L，25nmol/L，50nmol/L和100nmol/L）和不同转染时间（6h，12h，24h，48h和72h）时细胞的绿色荧光强度和荧光表达率，从而评价siRNA在心脏成纤维细胞的转染效率和转染持续时间。用JEDA-801D形态学图像分析系统计算转染细胞中绿色荧光蛋白的积分光密度值。2ET-1siRNA抑制Ald诱导的心肌纤维化在Ald诱导的心肌纤维化细胞模型中应用ET-1siRNA转染心脏成纤维细胞，以探讨ET-1在Ald诱导的心肌纤维化中的作用。无菌条件下开胸剪取SD大鼠心室，用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得心脏成纤维细胞。试验采用3-4代心脏成纤维细胞，随机分为以下5组：（1）空白对照组：细胞仅加入培养基Opti-MEM I。（2）Ald+control siRNA组：细胞加入Opti-MEM I培养基，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和control siRNA的混合溶液，并加入Ald诱导细胞纤维化。（3）Ald+ET-1siRNA1组：细胞加入Opti-MEM I培养基，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和ET-1siRNA1的混合溶液，并加入Ald诱导细胞纤维化。（4）Ald+ET-1siRNA2组：细胞加入Opti-MEM I培养基，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和ET-1siRNA2的混合溶液，并加入Ald诱导细胞纤维化。（5）Ald+ET-1siRNA3组：细胞加入Opti-MEM I培养基，以及LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂和ET-1siRNA3的混合溶液，并加入Ald诱导细胞纤维化。采用ELISA法检测心脏成纤维细胞和培养上清液中ET-1的变化（每组n=6），MTT法检测心脏成纤维细胞的增殖（每组n=8），羟脯氨酸含量测定法检测细胞培养上清液中胶原的含量（每组n=6）。结果：1.1同一时间点不同浓度siRNA的转染结果空白对照组和LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂组，在各时间点的明场两组间心脏成纤维细胞的数量无明显差异，表明本实验中使用的LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂的浓度对细胞毒性较低；在荧光观察时均未看到带绿色荧光的细胞，说明siRNA转染具有特异性。不同浓度siRNA转染组在6h和12h均可在多数心脏成纤维细胞的胞质和胞核观察到明显的绿色荧光，在24h荧光强度明显增强，并持续到48h，72h时荧光强度有所降低，但仍然较强。在6h和12h时，心脏成纤维细胞的转染效率和绿色荧光蛋白的积分光密度值随着siRNA转染浓度的增加呈浓度依赖性增加。在24h和48h时，各siRNA转染浓度组的转染效率和绿色荧光蛋白的积分光密度值均较高，100nmol/L组与其它各组有统计学差异（P<0.05）。在72h时间点，低浓度组间转染效率和绿色荧光蛋白的积分光密度值变化明显（P<0.05），而高浓度组间变化不明显。1.2同一浓度不同时间点siRNA的转染结果在siRNA浓度12.5nmol/L时，转染6h组细胞的转染效率较低。与6h组相比，12h、24h、48h和72h组的转染效率均显著增加（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。SiRNA浓度在12.5nmol/L时，转染效率在24h组和48h组达高峰，72h组有所降低（P<0.05）。SiRNA浓度在25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L时，变化趋势基本与12.5nmol/L相似，但72h组转染效率降低的均较12.5nmol/L少，并且siRNA浓度在50nmol/L时，72h组与48h组相比无统计学差异。2.1Ald和ET-1siRNA对心脏成纤维细胞ET-1表达的影响ELISA结果表明，与空白对照组相比，Ald+control siRNA组细胞中ET-1含量显著升高（P <0.01）。给予ET-1siRNA后Ald+ET-1siRNA1、Ald+ET-1siRNA2和Ald+ET-1siRNA3组细胞中ET-1含量，与Ald+control siRNA组相比均显著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01），并且明显低于空白对照组（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。Ald+ET-1siRNA2组比Ald+ET-1siRNA1组和Ald+ET-1siRNA3组细胞中ET-1含量降低更明显，但无统计学差异。2.2Ald和ET-1siRNA对心脏成纤维细胞培养上清液中ET-1含量的影响ELISA结果表明，与空白对照组相比，Ald+control siRNA组细胞培养上清中ET-1的含量显著升高（P<0.01）。给予ET-1siRNA后Ald+ET-1siRNA1、2和3组细胞培养上清中ET-1含量，与Ald+control siRNA组相比均显著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01），并且明显低于空白对照组（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。Ald+ET-1siRNA2组比Ald+ET-1siRNA1组和Ald+ET-1siRNA3组上清中ET-1含量降低更明显，但无统计学差异。与Ald+control siRNA组相比，给予ET-1siRNA后的Ald+ET-1siRNA三组细胞培养上清中ET-1含量较细胞中ET-1含量的降低更明显。2.3Ald和ET-1siRNA对心脏成纤维细胞增殖的影响MTT结果表明，与空白对照组相比，Ald+control siRNA组的平均吸光度值明显升高（P <0.01）。与Ald+control siRNA组相比，给予ET-1siRNA后Ald+ET-1siRNA1、Ald+ET-1siRNA2和Ald+ET-1siRNA3组的平均吸光度值均显著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。Ald+ET-1siRNA1组的平均吸光度值仍高于空白对照组（P<0.05），而Ald+ET-1siRNA2和Ald+ET-1siRNA3组的平均吸光度值与空白对照组无统计学差异。2.4Ald和ET-1siRNA对心脏成纤维细胞培养上清中胶原含量的影响羟脯氨酸含量测定表明，与空白对照组相比，Ald+control siRNA组细胞培养上清中胶原含量显著升高（P<0.01）。给予ET-1siRNA后Ald+ET-1siRNA1、Ald+ET-1siRNA2和Ald+ET-1siRNA3组细胞培养上清中胶原含量，与Ald+control siRNA组相比均显著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01），但仍高于空白对照组（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。Ald+ET-1siRNA三个组间细胞培养上清中胶原含量无统计学差异。结论：应用LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂可高效地将siRNA转染进培养的大鼠心脏成纤维细胞，转染时间可持续到72h后，并且对细胞的毒性较低。应用ET-1siRNA研究表明，ET-1可能在醛固酮诱导的心肌纤维化中发挥重要作用。