肥胖和2-型糖尿病(T2DM)已发展成为21世纪全球面临的最严重、最危急的健康问题之一,并将成为导致过早死亡的第三大危险因素。众所周知,糖尿病患者代谢紊乱、血糖升高,需要长期服用药物降低血糖,但常常引起毒副作用,如心血管疾病和糖尿病肾病等。天然产物由于其高度的生物安全性,已成为抗糖尿病药物研究的热点,其中天然活性多糖尤为引人注目。由于天然多糖本身结构的复杂性及其分离纯化困难,目前抗糖尿病多糖的活性及作用机制研究尚不系统、深入。本论文以享有“生物效应调节剂”美誉的酵母多糖作为天然活性多糖的代表,通过分离纯化得到一种酵母β-葡聚糖(BYG),在高脂饮食(HFD)—链脲佐菌素(STZ)联合诱导、高脂饮食诱导(DIO)、基因缺陷自发诱导(ob/ob)的肥胖/2-型糖尿病小鼠模型中,以灌胃方式口服给药,结合化学与分子生物学研究手段,深入研究BYG对肥胖/2-型糖尿病小鼠的葡萄糖、脂肪等代谢活动的调控,阐明它的作用机制。本论文的主要创新点包括:(1)从酵母粗多糖中分离纯化得到一种高纯度、化学结构清楚的线型β-(1→3)-葡聚糖(BYG),发现它具有显著的降血糖活性。(2)证明口服BYG抑制肠道葡萄糖转运体SGLT-1蛋白降低肠道对葡萄糖的吸收,并抑制肠道脂肪消化和转运相关蛋白和基因降低肠道脂肪吸收和利用。(3)证明口服BYG改善肥胖和2-型糖尿病小鼠肠道微生物的分布,显著提高与抗肥胖、抗胰岛素抵抗、抗炎症活性密切相关的菌群比例。(4)采用RNA-Seq测序分析,系统研究了 BYG对肝脏和脂肪组织的代谢调控,发现它在基因转录水平上抑制肝脏糖质新生、脂肪合成基因表达,改善脂肪组织微环境、能量代谢相关基因的表达。(5)揭示BYG有效抑制肥胖/2-型糖尿病引起的肠道和脂肪组织的慢性炎症。本论文的主要结果如下。从酵母粗多糖粉末中成功分离纯化得到一种纯度为>95%的水不溶性多糖BYG。用红外光谱、1D和2D核磁共振等解析BYG是一种线性β-(1,3)-葡聚糖。通过粘度法测量它在DMSO中25℃时的特性粘度[η]为29 mL/g,结合文献报道的Mark-Houwink方程计算其粘均分子量(Mη)为25 kD;基于BYG的线性结构用DNS方法测得它的数均分子量(Mn)约为10kD,由此计算得到BYG的多分散系数为2.5。体外试验证明,BYG可能通过上调p-AKT表达促进C2C12成肌细胞对葡萄糖的吸收利用。体内试验证明,BYG显著降低HFD-STZ联合诱导的糖尿病小鼠、DIO小鼠、ob/ob小鼠的血糖水平。由此,BYG可作为降血糖候选药物用于预防和治疗肥胖/2-型糖尿病患者,具有应用前景。采用FITC荧光标记的方法,通过体内外试验考察口服酵母葡聚糖的吸收和代谢分布情况,结果证明,BYG主要附着于肠道粘膜上经由粪便直接排出,少量BYG进入血液循环,分布到肝脏、脾脏等组织。通过肥胖/2型糖尿病小鼠肠道粘膜、Caco-2细胞的western blot试验以及Caco-2单细胞层模型的葡萄糖转运试验证明,BYG通过抑制肠道葡萄糖转运体SGLT-1和GLUT-2的表达,减缓肠道对葡萄糖的转运吸收,有效降低餐后血糖。BYG通过结合胆酸降低胆酸在肠道内对脂肪的乳化能力,从而减缓肠道对脂肪的消化;同时,口服脂肪耐受试验、RNA-Seq测序等结果证明,BYG通过抑制肠道内分解、合成、运输脂肪的相关蛋白(p-ACC,FAS)和基因(Apoa4、Aadac、Apoc2、Fabp1等)的表达,减缓肠道对脂肪的吸收利用,降低血液中甘油三酯的含量。此外,16s-rDNA测序、气相色谱与质谱连用(GC-MS)等结果表明,BYG有效改善肠道微生物分布,尤其提高Akkermansia菌群比例,并酵解产生更多的短链脂肪酸,全面改善机体的能量代谢平衡。口服BYG有效改善了肥胖/T2DM小鼠肝脏糖脂代谢平衡。Western blot结果揭示BYG通过上调葡萄糖转运体GLUT-2和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达提高胰岛素敏感性,促进肝脏对葡萄糖的吸收利用和肝糖原合成实现下调血糖水平。此外,RNA-Seq结果证明BYG通过下调ob/ob小鼠肝脏中糖质新生基因G6pase和Got1,脂肪酸合成基因Acly、Acc、Fas、Elovl6和Acot3,甘油酯合成基因Gpam和Lipin1/2,胆固醇合成及胆汁酸代谢基因Hmgcr、Fdps、Msmo1、Sc5d、Cyp7al和Cyp8b1等,抑制肝脏糖质新生和脂质合成,从而减少肝脏葡萄糖输出、降低血糖,抑制脂肪在肝脏的堆积。细胞试验证明,BYG通过间接作用调控肝脏糖脂代谢。通过RNA-Seq测序分析,BYG引起ob/ob小鼠脂肪组织中的325个基因发生显著差异表达,其中248个上调,67个下调,表明脂肪组织是BYG调控代谢平衡的重要器官。BYG显著抑制Hnf-4a、Apoa1、Apoa4基因的表达,并上调脂肪分解抑制基因Ptgs2和Npy的表达水平,表明BYG可能通过抑制脂肪组织脂肪分解,从而缓解血液及肝脏中的脂肪压力,改善脂肪代谢平衡。同时,BYG抑制了肥胖及糖尿病脂肪组织中过度的细胞外基质、纤维化、血管增生,改善脂肪组织微环境。此外,BYG还影响了脂肪组织固醇类激素合成及转变相关基因。通过细胞因子测定、流式细胞术、RT-PCR以及RNA-Seq等方法从蛋白质和基因水平证明口服BYG抑制肥胖/2-型糖尿病小鼠的慢性炎症。在肥胖/2-型糖尿病小鼠脂肪组织中,BYG通过减少脂肪组织巨噬细胞浸润、抑制促炎症巨噬细胞数量、增加抗炎症细胞数量、减少脂肪组织分泌的促炎症脂肪细胞因子,抑制脂肪组织的慢性炎症。在DIO小鼠模型中,高脂饮食引起DIO小鼠肠道慢性炎症,产生IL-6等促炎症因子,扰乱肠道微生物菌群分布及免疫系统;口服BYG显著抑制了 IL-6的分泌,抑制高脂饮食引起的免疫基因表达水平的变化,改善肥胖和2-型糖尿病的代谢异常。同时,口服BYG通过肠道内淋巴细胞摄取与运输分布到全身某些器官和组织,对脂肪组织等周身器官的炎症水平进行调控。本论文对酵母β-葡聚糖抗肥胖/2-型糖尿病活性及机制的深入研究,不仅为多糖在预防和治疗代谢类疾病中的开发与利用提供重要科学依据,而且有效促进多糖功能食品与药物的开发应用,具有重要学术价值和应用前景。