类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种多因素引起的慢性、系统性炎症疾病。其主要特征是滑膜炎症,最终导致关节破坏和变形。研究证明促炎症细胞因子如白介素-1 (interlukin-1, IL-1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)和炎症介质如前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)在RA发病中起到重要作用。调节细胞因子和破坏性酶产生的信号转导也参与了RA的病理过程,并呈现潜在的治疗靶点,如异三聚体鸟苷酸结合蛋白(heterotrimeric guanine nucleotide binding proteins, G protein)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等信号转导都参与了RA慢性滑膜炎。G蛋白-腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase, AC)-3’5’-环磷酸腺苷(cyclic adenosine 3’5’-monophosphate, cAMP)介导细胞外信号传入胞内,是一个从原核生物到真核生物的重要信号转导路径。本课题组研究发现,在佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠滑膜细胞中,激活性G蛋白(stimulatory subunit of G protein, Gs)mRNA和cAMP水平降低,抑制性G蛋白(inhibitory subunit of G protein, Gi)mRNA表达增加;Gi1, Gi2, Gi3表达异常增多,Gs表达降低;PGE2受体EP2和EP4表达降低;β-arrestins和G蛋白偶联受体激酶2 (G protein-coupled receptor kinase2, GRK2)转膜减少。提示在AA大鼠滑膜细胞中,G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)、GPCRs调节蛋白、G蛋白以及G蛋白偶联信号转导都出现异常。在胶原性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠滑膜细胞中, Gs mRNA和cAMP水平降低,Gi mRNA表达增加;百日咳毒素(pertussis toxin, PT)催化的ADP-核糖基化水平升高,霍乱毒素(cholera toxin, CT)催化的ADP-核糖基化水平降低;β-arrestins, GRK2, GRK5和GRK6的表达水平明显升高,这些结果提示CIA大鼠滑膜细胞中Gi蛋白和Gs蛋白功能失平衡,G蛋白偶联信号转导异常。Ras-Raf-MAPK激酶(MAPK/ERK kinase, MEK)–细胞外信号相关激酶(extracellular signal-related kinase, ERK)是一个广泛表达在细胞内的信号转导路径,该路径通过一系列磷酸化作用控制着细胞的增殖、分化和凋亡等功能。Ras是单聚体GTP结合蛋白,它可通过Raf/MEK/ERK激酶级联把丝裂原信号从细胞浆膜传递到细胞核。Raf是一个丝氨酸-苏氨酸激酶,它可磷酸化活化MEK1/2,MEK1/2依次磷酸化ERK1/2。MAPKs级联参与了RA的滑膜炎症和组织破坏,特别是RA成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)中ERK1/2高度活化。本课题组前期研究发现,AA大鼠滑膜细胞中ERK1/2, Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p38磷酸化程度明显增强;外源rIL-1α可引起滑膜细胞中ERK1/2, JNK和p38的迅速磷酸化。这些结果也提示AA大鼠滑膜细胞中MAPKs信号转导异常。有文献报道,在人肾胚293细胞中,GRK2与MEK存在于同一个多分子复合物中,GRK2调节ERK的活性,GRK2水平升高能够明显减低ERK对化学趋化因子的应答。在小鼠心肌细胞中,刺激β肾上腺素能受体(beta-adrenergic receptor,βAR)能够活化MAPKs特别是ERK1/2,ERK1/2参与调节许多细胞的生理过程。在N18TG2神经瘤细胞中,Gi蛋白可活化ERK1/2,活化的ERK1/2也可被Gi蛋白的抑制剂PT所抑制。在HEK 293细胞和气道平滑肌细胞中,血小板衍生因子(platelet derived growth factor, PDGF)受体在PDGF存在下,通过经典的GPCRs介导路径诱导ERK1/2有效活化;G蛋白信号转导调节因子(regulators of G protein signaling, RGS)可降低PDGF诱导的ERK1/2活化。本课题组也初步研究发现,Gs蛋白激活剂CT也能抑制AA大鼠FLS中rIL-1α诱导的ERK, JNK和p38的磷酸化。U 0126和SB 203580分别是MEK1/2和p38的抑制剂,二者都可降低AA大鼠FLS中G i1, G i2, G i3, G s和cAMP水平。这些研究提示在一些肿瘤细胞、心肌平滑肌细胞和RA滑膜细胞中MAPKs信号转导与G蛋白-AC-cAMP信号转导存在一定联系。芍药苷(paeoniflorin, Pae)是一个单萜糖苷,是亳白芍干燥根中提取的白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)的一个主要活性成份。作为疾病调修抗风湿药(disease modifying antirheumatic drug, DMARD),TGP于1998年被批准上市。TGP具有抗炎和免疫调节作用,并一直用于治疗RA。它能够改善RA的临床症状和体征,在恢复和调节RA异常免疫功能中发挥重要作用。研究表明TGP临床疗效与甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)相当,但不良反应比MTX少而轻。TGP也抑制角叉菜胶(carrageenan)诱导的急性炎症反应和AA大鼠的慢性炎症反应,抑制骨的破坏和滑膜细胞超微结构的改变。在AA大鼠FLS中,TGP抑制细胞增殖、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和Gi蛋白的表达,降低ERK1/2, p38和JNK的磷酸化作用,增加Gs, EP2和EP4蛋白的表达。TGP中含有90%以上的Pae,采用有机溶剂提取,柱色谱法从TGP中分离纯化得到Pae;依据其理化性质和质谱分析,鉴定Pae化学结构;采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定Pae含量。整体用药Pae明显减低AA大鼠继发性足爪肿胀和关节炎评分,降低肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)淋巴细胞增殖反应。体外,Pae降低MLN淋巴细胞β-arrestin 1/2的表达,升高βAR和GRK2的表达。本课题组以往初步研究表明实验性大鼠滑膜细胞MAPKs信号转导与G蛋白- AC -cAMP信号转导存在一定联系,但MAPKs信号转导活化后通过哪个环节调节G蛋白- AC -cAMP信号转导?G蛋白- AC -cAMP信号转导活化后通过哪个环节发挥对MAPKs信号转导的调节作用?两条信号转导交叉联系的关键位点在哪里? Pae是否影响两个信号转导间的联系?如果有影响,那么是通过哪个环节调节两个信号转导联系?目前还不清楚。本研究建立大鼠CIA模型,分离培养FLS,分别采用rIL-1α(一个炎症细胞因子)、U0126(MEK1/2选择性抑制剂)、盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline hydrochloride, Iso,β受体激动剂)和氨茶碱(aminophyline, Ami,非选择性磷酸二脂酶(phosphodiesterases, PDEs)抑制剂作用于FLS,首次探讨Ras-Raf-MEK- ERK和G蛋白- AC–cAMP两信号转导交叉对话的关键位点及Pae调节两信号转导交叉对话的作用环节。目的1. Iso和Ami分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达变化, rIL-1α和U0126分别作用于CIA大鼠FLS,检测FLS中Gi表达、cAMP水平和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,探讨两信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点。2.根据FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2, p-ERK1/2, Gi, cAMP水平和PKA活性的变化,观察CIA大鼠FLS在Ami, rIL-1或U0126分别作用下,Pae对Ras-MAPKs和G蛋白- AC–cAMP两信号转导交叉对话的影响及通过哪些环节发挥调节作用。方法用鸡Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen, CⅡ)免疫Sprague-Dawley(SD)大鼠诱导CIA。在炎症出现后,灌胃给予CIA大鼠Pae(25, 50, 100 mg·kg-1),每天一次。大鼠体重每隔4天称重一次。用MK-550容积仪每隔4天测量大鼠右后足爪容积。采用0-4分尺度每隔4天评定关节炎指数(arthritis index, AI)。进行大鼠膝关节组织病理分析。分离和培养FLS。FLS被不同的激动剂、抑制剂或药物作用如Iso, Ami, rIL-1, U0126或Pae。采用3H-TdR掺入法检测IL-1的活性。TNF-α和PGE2的产生分别采用125I放免试剂盒测定。运用免疫组化和Western blotting技术检测滑膜细胞中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。用竞争蛋白结合分析法(competitive protein binding assay, CPBA)检测滑膜细胞中cAMP水平,用激酶发光分析法测定滑膜细胞中PKA的活性。结果Ⅰ.CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs与G蛋白- AC–cAMP信号转导的交叉对话及关键作用交叉位点1.大鼠CIA建立与评价。在CIA大鼠中可见明显的炎症反应,体重增长缓慢,足爪肿胀,关节炎指数升高,伴有关节滑膜组织增生、血管翳形成和软骨侵蚀。IL-1活性增强,TNF-α和PGE2的产生增加。2. CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。CIA大鼠FLS中Gi, Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达增加。Gi, Ras, Raf和p-ERK1/2的表达在d20至d28较高,在d20前后p-MEK1/2的表达较高。3. Ras-MAPKs信号转导对G蛋白-AC-cAMP信号转导的影响。rIL-1α可促进Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,提高Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。U0126可抑制rIL-1α诱导的p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,降低rIL-1α诱导的Gi蛋白表达、cAMP水平和PKA活性。rIL-1α作用15min后,Ras和Raf表达水平开始升高,作用30 min后,Gi表达水平开始升高。U0126作用30 min后,p-MEK1/2表达下降,作用60 min后,cAMP水平和PKA活性开始下降。这些结果提示Ras-MAPKs路径的活化可以促进G蛋白偶联信号转导;抑制MAPKs级联应答能抑制G蛋白偶联信号转导。4. G蛋白-AC-cAMP信号转导对Ras-MAPKs信号转导的影响及作用交叉位点。Iso可促进Gi蛋白表达,升高cAMP水平和PKA活性,但对Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2无明显影响。Ami能抑制Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2表达,升高cAMP水平和PKA活性,对Gi蛋白表达无影响。Ami作用15 min时,开始提高cAMP水平和PKA活性;作用30 min时,Ras表达开始下降。这些结果提示升高cAMP水平和PKA活性能够抑制Ras–MAPKs级联应答;其作用交叉位点可能是通过PKA下调膜蛋白Ras表达,而进一步抑制Ras-MAPKs信号转导。Ⅱ. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导和Ras-MAPKs信号转导两信号转导路径联系的调节及作用环节1. Pae抑制CIA大鼠炎症反应及FLS中炎症介质的产生。Pae恢复CIA大鼠降低的体重,抑制足爪肿胀,减低AI,改善组织病理。Pae也明显抑制FLS中IL-1的活性及TNF-α和PGE2的产生。2. Pae对CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Gi蛋白表达增加,cAMP水平和PKA活性下降。Pae体内和体外可以抑制Gi蛋白的表达,恢复低下的cAMP水平和PKA活性。3. Pae对CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信号转导的调节作用。CIA大鼠FLS中Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达增加。体内和体外给予Pae后,Ras, Raf, p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达明显下降。4. Pae调节CIA大鼠FLS中G蛋白-AC-cAMP信号转导和Ras-Raf-MEK-ERK信号转导交叉联系及作用环节。4.1 Pae作用30 min开始抑制Gi表达;作用60 min开始抑制Ras表达;提示Pae可能首先通过抑制Gi表达,提高PKA活性,PKA再下调Ras表达,进一步抑制Ras- MAPKs信号转导。4.2 rIL-1α促进FLS中Ras和Raf的表达,增强Gi表达,提高cAMP水平和PKA活性。Pae(2.5mg·L-1)能够抑制rIL-1α诱导的Ras和Raf的表达,抑制Gi的表达,并进一步上调cAMP水平和PKA活性。表明Ras-MAPKs路径的活化可以促进G蛋白偶联信号转导,这种促进作用可以被Pae抑制。4.3 U0126抑制FLS中p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,抑制Gi的表达,降低cAMP水平和PKA活性。Pae(2.5mg·L-1)进一步下调U0126作用下的Gi蛋白表达,恢复U0126诱导下降的cAMP水平和PKA活性;也进一步抑制p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。表明抑制MAPKs级联应答能抑制G蛋白偶联信号转导,Pae可能通过抑制Gi表达,提高cAMP水平和PKA活性。4.4在Ami作用下,FLS中Ras, Raf蛋白的表达明显降低,cAMP水平升高,PKA活性增强。Pae(2.5mg·L-1)进一步下调Ras和Raf的表达。进一步升高cAMP的水平和PKA的活性。表明PKA活性增强能够抑制Ras-MAPKs级联应答。上述结果提示Pae能够影响G蛋白偶联信号转导和Ras-MAPKs信号转导交叉对话;通过抑制Gi蛋白表达,上调cAMP水平和PKA活性,从而抑制Ras-MAPKs信号转导,可能是Pae调节两信号转导交叉联系的主要作用环节。结论1.CIA模型是RA的一个慢性、免疫性炎症模型。该模型一直广泛用于RA病理机制的研究和用于评价抗关节炎药物。2. CIA大鼠FLS中,Ras–MAPKs和G蛋白-AC-cAMP信号转导间存在交叉联系。Ras-MAPKs路径的活化可以促进G蛋白偶联信号转导;抑制MAPKs级联应答能抑制G蛋白偶联信号转导。升高cAMP水平和PKA活性能够抑制Ras–MAPKs级联应答;关键作用交叉位点可能是通过PKA下调膜蛋白Ras表达,而进一步抑制Ras-MAPKs信号转导。3. Pae对CIA大鼠有抗炎和免疫调节作用。Pae可以抑制CIA大鼠炎症反应及FLS中炎症介质的产生。4. Pae调节CIA大鼠FLS中G蛋白- AC–cAMP信号转导,抑制Gi蛋白的表达,升高cAMP水平,增强PKA活性;Pae调节CIA大鼠FLS中Ras-MAPKs信号转导,抑制Ras-MAPKs级联活化;Pae调节G蛋白- AC–cAMP信号转导和Ras-MAPKs信号转导的交叉联系,其作用环节可能是Pae通过抑制Gi蛋白表达,上调cAMP水平和PKA活性,进一步抑制Ras-MAPKs信号转导。这也是Pae发挥抗炎和免疫调节作用的机制之一。5. Pae是一个新的具有抗炎和免疫调节作用的生物活性单体。Pae对CIA的抑制作用表明其对治疗RA具有一定前景。