鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我国南方及东南亚地区高发的一种恶性肿瘤,具有明显的区域分布特征、种族聚集性以及强烈的转移倾向显著区别于其他头颈部肿瘤。目前所采用以放疗为主的综合治疗提高了鼻咽癌的局控率,但五年生存率无明显提高,远处转移是患者死亡的主要原因。因此,继续探索鼻咽癌转移的分子机制,积极寻找有价值的治疗新途径,减少转移的发生具有重大意义。本课题组在研究miR-26a抑制鼻咽癌增殖的分子机理时,发现其靶基因为果蝇zeste基因增强子人类同源物(enhancer of zeste homolog2, EZH2)。采用荧光定量PCR证实EZH2在高转移鼻咽癌细胞株5-8F中显著高表达,且在发生转移的鼻咽癌组织中显著高于未发生转移的癌组织。基于这些实验结果把EZH2定为促进鼻咽癌转移的候选癌基因。EZH2是PcG (polycomb group genes)家族中的一员,与胚胎发育、细胞分化、肿瘤干细胞的自我更新及多种恶性肿瘤的发病密切相关。值得注意的是,EZH2位于人染色体7q35,比较基因组杂交技术(CGH, Comparative genomic hybridization)证实此染色体区带可能存在与鼻咽癌转移相关的基因。EZH2作为PCR2(polycomb repressive complex2)的催化亚基,其编码的蛋白含有高度保守的SET结构域,可通过三甲基化核小体组蛋白H3的27位赖氨酸(H3K27)或招募一系列效应蛋白如DNA甲基转移酶等催化DNA甲基化,来阻止转录因子与启动子区结合,最终实现基因沉默。多项研究表明,EZH2的表达失调与多种上皮源性和血液性肿瘤的发生发展密切相关,其高表达可以促进癌细胞的浸润和转移,尤为重要的是EZH2还可以作为前列腺癌和乳腺癌病人预后判断的一个分子指标。EMT(Epithelial mesenchymal transformation)是上皮细胞在形态上发生成纤维细胞或间质细胞表型的转变,获得迁移和侵袭能力,拥有干细胞的特性,防止程序性凋亡、衰老及抑制免疫原反应。EMT有利于组织修复,加快脏器的纤维化及通过多种分子机制促进肿瘤的进展,特别在上皮源性肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用。近年研究发现,EZH2可有序地沉默下游靶基因如上皮钙粘素(E-cadherin)诱导EMT促进头颈部鳞状细胞癌的转移。EZH2siRNA转染胃癌细胞株MKN1后,免疫荧光表明β-catenin由核表达转向膜表达,有相关研究显示,β-catenin的核转位与EMT的发生密切相关。由此提示我们EZH2有可能通过EMT参与鼻咽癌转移。基于我们课题组的前期工作基础和文献依据,本课题拟通过免疫组化、荧光定量PCR和Western blot分别验证EZH2在鼻咽癌组织和细胞株中的表达,同时分析其临床意义；建立沉默或过表达EZH2的5-8F、6-10B鼻咽癌细胞模型,通过体内外实验,研究EZH2对鼻咽癌细胞侵袭和转移能力的影响；在EZH2表达失调后,通过荧光定量PCR、Western Blot分析EMT相关标志物的表达变化,本研究初步探讨EZH2在鼻咽癌转移中的功能和分子机制。材料和方法：1胞培养永生化鼻咽上皮细胞NP69采用KMSF培养基,人鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、HONE1、CNE1、CNE2采取含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的RPMI1640培养基,293FT细胞采用DMEM培养基,在37。、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。2.临床标本收集135例鼻咽癌组织和23例鼻咽慢性炎组织均来源于南方医院耳鼻咽喉科和病理科的标本库,其中97例鼻咽癌组织具有5年随访资料,所有标本均为鼻咽部活检组织所制备的蜡块,经病理检查确诊,鼻咽癌组织学分型为非角化性未分化型鳞癌,所有患者均未接受放化疗治疗。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者签署知情同意书。3.免疫组织化学待检组织的石蜡切片按SP免疫组化三步法进行染色,经切片脱蜡、抗原修复、阻断过氧化物酶、血清封闭、滴加一抗、滴加二抗、DAB显色、复染、透明、封片等步骤后光镜下观察显色结果。随机选取5个高倍视野,以阳性细胞数≥10%为阳性判定标准；以阳性细胞百分比为阳性积分；以阳性积分的中位数(50%)作为临界值,分为低表达、高表达组。4.慢病毒包装、浓缩及滴度测定plVTHM/shEZH2和plVTHM/EZH2:该慢病毒表达载体可分别稳定干扰和过表达EZH2,由香港中文大学医学院陈杨超教授惠赠。采用lipofectamineTM2000法,将慢病毒表达载体(plVTHM或plVTHM/shEZH2或plVTHM/EZH2)和慢病毒包装载体(psPAX2和Pmd2.G)共转染293FT细胞,培养48～72h后收集病毒上清,超速离心进行浓缩纯化,病毒颗粒命名为LV/shEZH2和LV/EZH2,空载组为LV/control,再倍比稀释进行滴度测定。5.细胞转染将慢病毒悬液感染鼻咽癌细胞,48h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)发光情况。鉴于慢病毒感染效率较高,以GFP为标记,利用流式细胞仪进行细胞分选获得GFP阳性细胞,分别建立稳定干扰EZH2和过表达EZH2的鼻咽癌细胞株。6.荧光定量PCR抽提细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-ΔΔCt值代表基因的相对表达强度。7. Western blot抽提细胞的总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交,超高灵敏度化学发光成像系统(Bio-Rad ChemiDoc XRS+Imaging System)成像,蛋白相对表达强度采用Image Lab软件进行定量。8.细胞生物学功能实验(1)划痕实验：将5×105/孔细胞接种于6孔板中,常规培养12h,用200u1的加样枪头垂直在培养孔中部制造多条互相平行的划痕。培养液冲去脱落细胞后继续培养,应用Image J软件观察并测量划痕后0h、24h、48h细胞向致伤区迁移的距离。(2) Invasion Chamber侵袭小室测定：胰酶消化细胞后以无血清培养基洗涤细胞制作细胞悬液,均匀加入200u1含1×105个细胞至小室上腔,加入600ul完全培基至transwell小室下腔,放置24h取出,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下计数穿膜细胞数。9.肝包膜下种植肝肺转移动物模型的建立选择4-6周龄的雄性裸鼠,体重18-24g,建立肝包膜下种植肝肺转移动物模型,24天后断髓处死裸鼠后取出裸鼠肝脏及肺脏组织,4%多聚甲醛固定、常规石蜡包埋并HE染色、显微镜下观察肿瘤细胞在肝肺内转移情况。10.EZH2表达失调对EMT相关指标的影响在EZH2表达失调和对照组的鼻咽癌细胞中应用荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光染色检测EMT上皮标志物(E-cadherin、CK18)与间质标志物(β-catenin和N-cadherin)的mRNA和蛋白水平表达情况。结果：1.鼻咽癌细胞中EZH2的表达荧光定量PCR结果显示,在5种鼻咽癌细胞株,即5-8F、6-10B、HONE1、 CNE1、CNE2的EZH2表达均高于永生化鼻咽上皮细胞NP69(F=707.589,P=0.000)。其中具有转移能力的5-8F细胞中EZH2的表达水平高于不转移的细胞6-10B。Western blot证实蛋白水平表达出现相同的变化。2.鼻咽癌组织中EZH2的表达(1)免疫组化结果表明：EZH2表达主要定位于细胞核。根据半定量积分计算,EZH2在135例鼻咽癌组织中阳性表达率为88.2%,该蛋白在23例鼻咽慢性炎组织中的阳性表达率为8.7%,两者表达有显著差异(P=0.000)。(2)根据EZH2的表达情况将鼻咽癌组织分成两组,高表达组和低表达组,经统计分析,EZH2的表达与患者的性别、年龄均无显著相关性(P>0.05)。EZH2的表达与患者的肿瘤T分期、N分期、M分期及临床分期存在显著正相关(P<0.05)。(3)应用Kaplan-Meier生存对具有5年随访资料的97例鼻咽癌组织进行分析,结果显示EZH2蛋白高表达组的鼻咽癌患者的生存时间较低表达组鼻咽癌患者明显缩短,差异具有统计学意义(p=0.000)。(4)Cox逐步回归模型检验示：M分期和EZH2蛋白的表达这2个因素是影响鼻咽癌患者生存时间的重要因素(P<0.05),肿瘤M分期对鼻咽癌患者的生存时间影响最大(P=0.000)。3.沉默或过表达EZH2对鼻咽癌细胞转移影响的体内外研究(1)建立稳定沉默和过表达EZH2的细胞株依据慢病毒载体携带的GFP标记,采用流式细胞仪分选获得GFP阳性细胞群,建立稳定沉默EZH2的鼻咽癌细胞株5-8F/shEZH2和稳定过表达EZH2的细胞株6-10B/EZH2。(2)沉默EZH2抑制鼻咽癌细胞迁移、侵袭能力划痕实验结果表明：沉默EZH2在24h、48h,均减慢鼻咽癌细胞迁移能力(P=0.000),划痕48h后其迁移能力下降了28.75%。侵袭实验结果显示：沉默EZH2降低鼻咽癌细胞的侵袭力(P=0.000),细胞侵袭力下降52.01%。(3)过表达EZH2促进鼻咽癌细胞迁移、侵袭能力过表达EZH2后,使本身不具有转移能力的6-10B细胞,穿透力更增强5.49倍。(4)EZH2沉默对鼻咽癌细胞体内侵袭和转移能力的影响接种5-8F/control和5-8F/shEZH2鼻咽癌细胞的裸鼠,24天后肝脏成瘤率为100%。HE染色显示,5-8F/control组肝内见肿瘤细胞广泛播散,肺转移灶呈巢状浸润,EZH2沉默组肝肺转移灶少且较局限。5-8F/control组的肝肺转移数目显著高于5-8F/shEZH2组(t=2.512, P=0.036;t=3.059。4.EZH2表达失调对EMT相关指标的影响(1)沉默EZH2可上调鼻咽癌细胞的上皮标志物,下调间质标志物荧光定量PCR均显示,沉默EZH2后,5-8F/shEZH2细胞的上皮标志物E-cadherin、Keratin18的mRNA水平分别上调1.83倍、1.61倍,间质标志物P-catenin、N-cadherin分别下调42.7%、41.5%。Western Blot分析其蛋白变化出现一致结果。(2)过表达EZH2后,上述EMT指标的mRNA和蛋白水平表达出现相反的趋势。结论：1.EZH2在鼻咽癌细胞和组织中的表达上调；免疫组化证实EZH2蛋白的表达与鼻咽癌的T分期、N分期、M分期和临床分期显著正相关；EZH2的表达水平与患者的生存时间密切相关,EZH2的高表达可作为鼻咽癌预后差的独立预测指标。2.沉默EZH2可抑制鼻咽癌细胞体外的迁移和侵袭能力,抑制体内肝肺转移能力；EZH2的过表达可促进体外迁移和侵袭能力,表明EZH2是促进鼻咽癌转移的癌基因。3.EZH2可通过诱导发生EMT促进鼻咽癌细胞转移。