1目的本研究着眼于临床组织工程的实际需求,对Percoll密度梯度离心法与全骨髓培养法分离培养人MSCs的效果进行了探索和比较,并且对各代MSCs的生物学特性进行一定的测定和分析,以期为将MSCs应用于骨损伤修复提供理论依据和技术基础。并通过电针诱导骨髓间充质干细胞成为成骨细胞与传统化学诱导法诱导骨髓间充质干细胞成为成骨细胞进行探索和比较,并且对两种方法诱导产生的成骨细胞的生物学特性进行一定的测定和分析,以期为将电针方法应用于人骨髓间充质干细胞诱导成骨提供一种新的方法,并应用于骨组织工程。2方法采取Percoll密度梯度离心法与全骨髓培养法人骨髓间充质干细胞,并对其进行鉴定。测定各代人骨髓间充质干细胞生物学特性。将3代人骨髓间充质干细胞随机分为三组,分为普通培养基组,化学诱导组和电针诱导组,进行28d诱导,检测诱导后细胞特性。从两种培养法分离培养的细胞形态上及生长速度进行比较。观测各代干细胞的形态学变化,MTT测定观察细胞活性,流式细胞仪检测细胞分裂期及凋亡期细胞比例。分组诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,观测其细胞形态变化,组织化学染色,分别于诱导14d和28d测定细胞中碱性磷酸酶含量,诱导28d采用RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达,采用western-blot法测定细胞中骨钙素蛋白含量。3结果实验结果显示,全骨髓培养法培养MSCs增殖较快,传代时间约早于密度梯度离心法2-3d。本研究通过对2代-11代MSCs MTT比色试验及流式细胞仪细胞周期分析发现:MTT值逐渐升高,当细胞增殖到第九代,达到最高,10代开始MTT值开始降;与此同时流式细胞仪细胞周期分析显示虽然细胞增殖到11代,分裂期细胞数量仍然呈上升趋势,但是从第6代开始凋亡细胞数量明显增加,第8代以后凋亡细胞数量达到60%以上,和从形态学观察中发现第9代后细胞生长减慢,并出现胞浆空泡化、胞体变大等老化现象基本一致。干细胞诱导成骨的实验中我们从形态学发现诱导初期,电针诱导组细胞形态变化慢于化学诱导组。其中化学诱导组5-7d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形,胞浆中含有较多的基质成分和颗粒状物质,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象,而此时电针诱导组细胞仍呈纺锤状,9-10d电针刺激组才发生上述的形态学观察。但是诱导后期形态学变化无明显差异,20-24d两组细胞均形成结节状,胶原堆积及钙盐沉积,形成不透光的矿化结节。28d时化学诱导组和电针刺激组细胞茵素红染色阳性,而普通培养组细胞染色阴性。碱性磷酸酶测定发现MSCs在体外进行诱导时电针刺激组和化学诱导组碱性磷酸酶含量随时间而增加,而与此对应的普通培养组碱性磷酸酶活性随时间而逐渐降低,普通培养组及电针刺激组和化学诱导组碱性磷酸酶含量在14天及28天时差异有统计学意义(t值分别为57.857、112.505、47098、108.808,P值均小于0.05);同时比较化学组和电针刺激碱性磷酸酶含量在14天时差异有统计学意义,但是28天时差异无统计学意义(t值分别为15.807、1.357,14天时P值小于0.05,28天时P值为0.212大于0.05)。28d时通过RT-PCR检测三组细胞中骨钙素mRNA的表达,发现电针刺激组和化学诱导组细胞中的骨钙素mRNA显示无统计学差异但于普通培养组相比都有统计学差异;通过western-blot检测三组细胞中骨钙素蛋白,发现电针刺激组和化学诱导组细胞中的骨钙素蛋白显示无统计学差异但于普通培养组相比都有统计学差异。4结论与Percoll密度梯度离心法相比较,全骨髓培养法分离MSCs具有培养时间较短,细胞得率较多的优点,尽管纯度相对较低,但也是一种较好的MSCs分离方法。另外,全骨髓培养法操作简便,污染机会少,只需少量的骨髓即可获取大量的MSCs细胞,减少了临床抽取骨髓的工作量和骨髓穿刺对患者的损伤,可以较好地满足临床需要。如果培养目的不是获取高纯度的MSCs,而是快速大量培养MSCs以满足临床移植需要,推荐使用全骨髓培养法培养。通过对各代MSCs生物学特性分析,推荐使用第3至第6代MSCs用于临床治疗使用。与化学诱导方法相比,电针刺激也能成功的将MSCs诱导成成骨细胞,尽管诱导初期诱导速度慢于化学诱导法,但诱导28d时两种诱导方法所得的细胞在从其形态学、组织化学、细胞内成分上无明显不同。因此我们可以认为电针能成功的将MSCs诱导为成骨细胞,而且由于是物理作用,故和化学作用机制相比,潜在的毒副作用较小,可作为一种新的MSCs诱导成骨的方法应用于骨组织工程。