体细胞核移植突破了物种之间的“生殖隔离”限制,涉及物种之间在分子、细胞和生理水平上的相互作用。因此,该技术为研究核质互作的规律和特征及拯救濒危动物提供了新的途径。同时异种体细胞核移植也许是再现某些已经灭绝动物的唯一途径。但是由于卵母细胞核外遗传物质即线粒体DNA常被带入核移植胚中,使得目前的“克隆”并非真正意义上的“克隆”,实际上是一种带有供体和受体两种细胞mtDNA的异质体。因此为了提高体细胞核移植效率,同时也为得到完全意义上的克隆动物,我们重点研究了线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响及体细胞核移植过程中线粒体的变化。1.制备牛和绵羊mtDNA实时荧光定量PCR标准品。用Primer 5.0软件设计牛和绵羊mtDNA荧光定量PCR特异性引物,将牛、绵羊卵母细胞直接裂解后作为PCR模板,PCR扩增目的片段后连接到pMD18-T载体上,用大肠杆菌DH5-α增值。最后对提取的质粒进行纯化,再分别按照梯度稀释进行荧光定量PCR。结果表明构建的牛、绵羊mtDNA定量PCR标准曲线分别跨越100～106和100～105数量级,两种标准曲线的线性关系良好。2.确定牛卵母细胞内线粒体的量与卵母细胞质量及随后胚胎发育之间的关系。根据颗粒-卵母细胞复合体表面特征将卵母细胞分为好和差两类。采用定量PCR的方法对卵母细胞内线粒体DNA进行检测,同时进行孤雌激活观察各类胚胎的发育。结果表明1)质量好的卵母细胞平均mtDNA拷贝数极显著高于差卵母细胞组;2)卵裂了的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显著高于卵裂了的差卵母细胞组;3)未卵裂的好卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显著高于未卵裂的差卵母细胞组;4)好卵母细胞组中,卵裂了的卵母细胞mtDNA平均拷贝数极显著高于未卵裂的卵母细胞组。同时好卵母细胞48 h内卵裂率和第8 d的囊胚形成率及囊胚细胞数极显著高于差卵母细胞组。因此质量好的卵母细胞与差卵母细胞相比,前者含有更多的mtDNA,并且卵母细胞内mtDNA的量与卵母细胞的质量和随后胚胎的发育成正相关。3.研究颗粒细胞线粒体移植对牛体外胚胎发育的影响。采用分步离心法从颗粒细胞中提取线粒体,并分别注射到孤雌激活和ICSI胚内。结果表明无论是胞质内注射还是孤雌激活,注射了线粒体的差卵母细胞组在桑葚胚率、囊胚率及孵化囊胚率上与好卵母细胞组相比较,在统计学上无显著差异,但是显著高于未注射线粒体的差卵母细胞组;同样在囊胚细胞数上,好卵母细胞组和注射了线粒体的差卵母细胞组在统计学上无显著差异,但是他们都显著高于未注射线粒体的差卵母细胞组。因此,卵母细胞内线粒体的含量对于牛胚胎的早期发育非常重要,并且线粒体移植可以改善着床前胚胎的发育潜力。4.研究同种体细胞核移植胚内线粒体的变化。用线粒体特异性荧光探针对颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞内线粒体进行标记,再与去核的牛卵母细胞构建成胚胎,同时以未标记的供体细胞所构建的重组胚为对照。结果表明1)由颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞构建的重构胚在发育潜能上无差异;2)线粒体特异性荧光探针对重组胚的发育无影响;3)在16-细胞期前,各组能激发荧光的胚胎比率在统计学上无显著差异,而从桑葚胚开始,由颗粒细胞而来的胚胎能激发出荧光的比率要显著低于其他两类供体细胞构成的胚胎。说明核移植胚胎的发育潜能与供体细胞的类型无关,而颗粒细胞内线粒体在重组胚中被整合的效率要高于相应的胎儿成纤维细胞和成年成纤维细胞。5.构建牛-绵羊异种体细胞核移植胚。以牛卵母细胞为胞质受体,以绵羊胎儿成纤维细胞为供体细胞构建异种重构胚,并且对重构胚胎的染色体构成、胚胎形态及囊胚细胞进行了观察和分析。结果表明1)绵羊胎儿成纤维细胞在牛卵母细胞胞质的作用下能够去分化,构建的重构胚胎能够发育到囊胚阶段;2)66%的重构胚胎具有体细胞同样数目的染色体;3)重构胚胎的囊胚细胞数可以与绵羊孤雌激活胚胎的相比。说明绵羊胎儿成纤维细胞核能在去核的牛卵母细胞内进行去分化,并且构建的重构胚胎在核行和表型上比较正常。6.研究牛-绵羊异种体细胞核移植胚中线粒体的分配。采用荧光定量PCR的方式对牛-绵羊异种体细胞核移植早期胚胎及胚胎卵裂球中的mtDNA进行了定量分析。结果表明,从1-cell阶段到8-cell阶段,供体细胞mtDNA占受体胞质mtDNA的1%,而在16-cell阶段和囊胚阶段分别为0.6%和0.1%。说明随着异种重构胚的发育,两种来源的线粒体无论是在同一卵裂球内还是在同一胚胎内都是非均匀分配的。