农杆菌介导的玉米高效遗传转化体系的建立及CgbHLH001转基因玉米株系的鉴定

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玉米是世界重要的粮食、饲料作物,也是现代食品、医药和化学工业的重要原料。而干旱则是影响玉米生长发育并导致产量和质量下降的最主要的环境因素。传统玉米育种技术由于周期长且难以维持玉米的产量等问题,一直无法满足社会需求。因此利用转基因技术选育耐旱玉米新品种具有重要的意义。农杆菌介导的基因转化法是目前广泛应用于玉米等农作物的遗传转化方法,与其他转基因方法相比具有成本低、外源基因单拷贝插入、稳定遗传等优点。基于此,本研究拟通过农杆菌介导法将来自盐生植物灰绿藜的耐旱转录因子CgbHLH001(碱性螺旋环螺旋转录因子)基因转入优良玉米自交系中,同时对遗传转化体系的主要影响因素进行优化,旨在建立高效稳定的农杆菌介导的玉米遗传转化体系,并创制耐旱转基因玉米新种质,为选育耐旱玉米品种、加快我国转基因玉米研究与产业化进程提供依据。本研究主要获得了如下研究结果:1.不同基因型玉米幼胚诱导愈伤组织实验结果表明,本实验选取的四个玉米自交系基因型间形成愈伤的能力差异不大,各玉米自交系幼胚均能诱导出初级愈伤组织。诱导愈伤组织最适2,4-D浓度为2.0或2.5 mg/L;最适分化培养基为MS+0.5 mg/L VB1(维生素B1)+0.5 g/L CH(水解酪蛋白)+30 g/L蔗糖+1.38 g/L L-pro(L-脯氨酸)+4 mg/L 6-BA;最适生根培养基为1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.5 mg/L IBA;筛选抗性愈伤组织的草铵膦(PPT)临界浓度为9 mg/L;筛选转化苗的PPT临界浓度为0.8 g/L。2.基于玉米幼胚的分化体系进一步优化了农杆菌介导的遗传转化体系并获得了抗逆基因CgbHLH001的转基因植株。分别转化了三种植物表达载体:CgbHLH001基因过表达载体、CgbHLH001基因干扰载体以及空载体,结果显示,当农杆菌菌液OD600=0.6,浸染时间25 min时得到自交系JH089转化过表达载体的较佳条件,该条件下获得的再生植株经PCR鉴定获得1株CgbHLH001过表达的JH089株系;当农杆菌菌液OD600=0.8,浸染时间15-20min时得到自交系JH089转化干扰载体的较佳条件,该条件下共获得3株PCR阳性的CgbHLH001 RNAi的JH089株系;当农杆菌菌液OD600=0.8,浸染时间30 min时得到自交系3604转化干扰载体的较佳浸染条件,该条件下获得1株PCR阳性的CgbHLH001 RNAi的新自3604株系。实验结果表明,不同玉米自交系的遗传转化效率有明显差异,其中自交系JH089较容易获得转化植株。3.利用农杆菌介导对玉米自交系JH089的种子萌动胚进行遗传转化条件的优化。结果显示,浸染时间和浸染的菌液浓度对出苗率均有一定的影响,合理的菌液浓度和浸染时间的组合对提高出苗率及转化率具有重要作用。与此同时,对玉米自交系JH089也进行了茎节愈伤组织的诱导,其愈伤诱导的最佳培养基为MS+0.5 mg/L VB1+0.5 g/L CH+30 g/L蔗糖+1.38 g/L L-pro+3.4mg/L Ag NO3+2.5 mg/L 2,4-D。
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