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目的:通过抗-TIM-4单抗（anti-TIM-4）体内阻断TIM-4分子,观察Th17细胞的变化,并探索miR-21以及相关lncRNA潜在的调控机制;通过构建同种异型小鼠皮肤移植模型,进一步观察anti-TIM-4+/-雷帕霉素（临床常用免疫抑制剂）是否协同促进移植物存活并观察体内Th17细胞的变化。为进一步寻求克服移植排斥反应的免疫抑制剂以及药物联合使用提供新的实验思路。方法:（1）根据前期基因芯片的结果和Freiburg RNA Tools网络软件预测,我们发现miR-21可能与Malat1、Kcnq1ot1、Gm12054和Gm25925等lncRNA结合并降低这些潜在的lncRNA,这些lncRNA也能够作为miR-21的“海绵分子”结合miR-21,抑制miR-21的作用。为了筛选出能够与miR-21结合的lncRNA,我们将miR-21 inhibitor和阴性对照（negative control,NC）转染至C57BL/6小鼠脾细胞。以实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）检测miR-21 inhibitor的干扰效率,同样以qRT-PCR检测相关lncRNA水平。（2）为了确定miR-21与筛选出的lncRNA（Malat1）作用的相互性,我们将si-Malat1和si-NC转染至C57BL/6小鼠脾细胞。以qRT-PCR检测si-Malat1的干扰效率,同样以qRT-PCR检测miR-21的表达情况。（3）前期结果我们发现体内干扰miR-21能够抑制Th17细胞,为了验证Malat1能够作为miR-21的“海绵分子”结合miR-21,干扰miR-21对Th17细胞的作用。我们以磁珠法分选出纯化的CD4+T细胞,在抗小鼠CD3/CD28 mAb以及IL-2刺激下,转染si-Malat1和si-NC,以qRT-PCR检测IL-17a的表达情况。（4）为了证明体内阻断TIM-4共刺激信号对Th17细胞的影响,并探索miR-21以及Malat1在其中的潜在机制,我们将balb/c小鼠脾细胞通过腹腔注射至C57BL/6小鼠构建同种异型抗原免疫小鼠模型,对照组和实验组分别腹腔注射同型对照（isotype）和anti-TIM-4单抗,于第10天取受体小鼠脾细胞,流式细胞术（Flow cytometry,FCM）检测对照组和实验组Th17细胞的比例。qRT-PCR检测磁珠法分选出的CD4+T细胞中IL-17a表达水平。qRT-PCR检测受体小鼠脾细胞miR-21和Malat1表达水平。（5）为了探索anti-TIM-4+/-雷帕霉素是否协同作用促进皮肤移植物存活并观察其体内Th17细胞的变化水平。我们将balb/c小鼠皮肤移植于C57BL/6小鼠构建同种异型皮肤移植模型,分别设isotype组、anti-TIM-4组、雷帕霉素组、雷帕霉素+isotype组、雷帕霉素+anti-TIM-4组,观察受体小鼠移植皮肤存活时间,于第8天取移植皮肤制作病理切片H-E染色和FCM检测各组脾细胞中Th17细胞的比例。结果:（1）MiR-21 inhibitor转染脾细胞后,其干扰效率可达80%,miR-21 inhibitor组Malat1相对表达量显著高于NC组（0.79±0.04 vs 0.25±0.11,p<0.01）。Si-Malat1转染脾细胞后,其干扰效率可达～45%,si-Malat1组miR-21相对表达量显著高于NC组（0.0000413±0.000005.3 vs 0.0000056±0.00000065,p<0.01）。在抗小鼠CD3/CD28 mAb刺激下,si-Malat1转染经磁珠分选的小鼠脾脏CD4+T细胞组,IL-17a相对表达量显著高于NC组（0.0039±0.00024 vs0.0021±0.00023,p<0.01）。（2）在同种异型抗原免疫小鼠模型中以anti-TIM-4体内阻断TIM-4分子,实验组与同型对照组相比,Th17细胞比例明显少于isotype组（2.82±0.17 vs 1.83±0.07,p<0.01）。小鼠脾脏CD4+T细胞中IL-17a相对表达量明显降低（0.00026±0.000009 vs 0.00079±0.000009,p<0.01）。而且实验组总体脾细胞和纯化CD4+T细胞中miR-21相对表达量均明显降低（脾细胞:0.4±0.12 vs 1.0±0,p<0.01;脾脏CD4+T细胞:0.02±0.007 vs 1±0,p<0.0001）。此外,以单克隆抗体阻断TIM-4分子后,Malat1相对表达量明显升高（0.3±0.059 vs 0.12±0.012,p<0.05）。（3）在小鼠同种异型皮肤移植模型中,单纯以anti-TIM-4给药,与同型对照组相比,虽然移植皮肤存活时间没有明显的延长,但其H-E染色结果显示,anti-TIM-4组浸润的炎症细胞轻度减少。anti-TIM-4和雷帕霉素联合用药组较同型对照组、anti-TIM-4组、雷帕霉素组、雷帕霉素和同型对照联合用药组相比,其生存时间明显延长（MST:TIM-4+雷帕霉素组,16.5天vs同型对照组,7天;vs anti-TIM-4组,8.5天;vs雷帕霉素组,10天;vs雷帕霉素+同型对照组,8天）。同样,H-E染色结果显示,anti-TIM-4和雷帕霉素联合用药组浸润的炎症细胞明显减少。（4）在小鼠同种异型皮肤移植模型中,单纯以anti-TIM-4给药,与同型对照组相比,受体小鼠脾脏Th17细胞明显减少（1.21±0.15 vs 2.81±0.31,p<0.05）。anti-TIM-4和雷帕霉素联合用药组与雷帕霉素组和雷帕霉素加同型对照组相比,Th17细胞显著降低（anti-TIM-4+雷帕霉素,1.0±0.015 vs雷帕霉素组,1.3±0.09,p<0.05vs雷帕霉素+同型对照组,2.03±0.21,p<0.05）。有趣的是,我们观察到,雷帕霉素加同型对照组的Th17细胞明显高于单纯雷帕霉素组（雷帕霉素+同型对照组,2.03±0.21 vs雷帕霉素组,1.3±0.09,p<0.05）。这可能是因为同型对照是Rat IgG2a型,是一种具有部分异种抗原性的蛋白,引起一定的背景免疫反应的缘故。这个结果也证实了同型对照抗体的Fc段能够与B细胞、巨噬细胞等细胞的Fc受体发生非特异性结合,而这些非特异性结合能够促进炎症反应[1]。结论:1.LncRNA Malat1能够作为miR-21的“海绵分子”,海绵吸附miR-21,干扰miR-21对Th17细胞的作用;2.Anti-TIM-4体内阻断TIM-4分子能够抑制Th17细胞免疫反应,其中的调控机制可能与miR-21的下调和Malat1上调有关;3.Anti-TIM-4和雷帕霉素联合作用能够促进小鼠同种异型皮肤移植物的存活。