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沉默信息调控因子2样蛋白3(silent information regulator 3,SIRT3或Sirtuin3)是线粒体内的主要去乙酰化酶,在调节人类及啮齿类动物脂代谢方面发挥关键作用,但对反刍类动物脂代谢的作用及机制暂不明确。本研究通过体外培养奶牛原代肝细胞,转染si-RNA和SIRT3过表达腺病毒以及配合不同浓度的非酯化脂肪酸(Non-esterified fatty acids,NEFAs)处理,探索SIRT3对奶牛原代肝细胞脂代谢的调节作用。方法与结果如下:1、采用两步-胶原酶灌流法分离培养犊牛原代肝细胞。结果显示:分离后细胞形状不规则,细胞核类似圆形、清亮、边界清晰,状态良好,可实行后续实验。2、采用Western blot、qPCR、油红染色检测不同浓度NEFAs对SIRT3表达的影响以及对脂滴生成的影响,发现0.3 mM NEFAs促进SIRT3的表达(P<0.001),0.6 mM、1.2 mM NEFAs抑制SIRT3的表达(P<0.001);0.6 mM、1.2 mM NEFAs处理导致肝细胞脂肪沉积,且呈剂量依赖性。3、采用qPCR检测SIRT3过表达、沉默以及高浓度NEFAs和SIRT3过表达共同作用对脂代谢相关基因FAS、ACC-1、CPT-Ⅰ、CTP-Ⅱ、ACO、MTP、Apo B、Apo E m RNA丰度的影响。结果显示SIRT3过表达抑制FAS、ACC-1的表达(P<0.05),促进ACO、CPT-Ⅰ、CTP-Ⅱ和载脂蛋白基因MTP、Apo B、Apo E的表达(P<0.001);SIRT3沉默对FAS、ACC-1的表达无明显影响(P>0.05),但抑制CPT-Ⅰ、CTP-Ⅱ、ACO、MTP、Apo B、Apo E表达(P<0.01);高浓度NEFAs促进FAS、ACC-1的表达(P<0.01),抑制CPT-Ⅰ、CTP-Ⅱ、ACO、MTP、Apo B、Apo E的表达(P<0.05),而SIRT3过表达能够抵消NEFAs对上述基因的作用(P<0.01)。4、生化试剂盒分别检测SIRT3过表达、沉默以及高浓度NEFAs和SIRT3过表达共同作用对细胞内TG含量的影响。结果显示SIRT3过表达降低细胞内TG含量(P<0.05);SIRT3沉默使细胞内TG含量略升高,但差异不显著(P>0.05);高浓度NEFAs显著增加细胞内TG含量(P<0.001),而SIRT3能够抵消NEFAs引起的TG升高(P<0.01)。5、ELISA分别检测SIRT3过表达、沉默以及高浓度NEFAs和SIRT3过表达共同作用对细胞培养液上清VLDL含量的影响。结果显示SIRT3过表达升高培养液上清中VLDL含量(P<0.01);SIRT3沉默降低细胞培养液上清中VLDL含量(P<0.05);高浓度NEFAs降低培养液上清中VLDL含量(P<0.05),而SIRT3能够抵消NEFAs的作用(P<0.01)。综上,SIRT3抑制脂合成相关基因的表达,促进脂分解相关基因表达,从而降低细胞内甘油三酯积累。本研究的结果可为探寻奶牛能量代谢障碍性疾病提供参考。