研究背景脓毒症（sepsis）是机体在应对病原微生物感染时出现的以全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）为特征的组织器官功能障碍,是极其复杂、极具威胁又难于治疗的临床病症,也是危重患者死亡的主要病因。脓毒症免疫功能紊乱是其致病的关键原因,包括第一阶段在病原微生物、创伤等因素作用下炎症细胞大量激活、促炎介质大量释放而产生的过度炎症反应,第二阶段炎症细胞大量凋亡、促炎介质大量耗竭而产生的免疫抑制甚至免疫麻痹。现阶段临床治疗手段主要是液体复苏、抗生素使用以及器官功能支持,尚不能有效调控其免疫功能紊乱,导致患者死亡率和致残率居高不下,严重影响患者健康并给社会带来极大经济负担。寻求脓毒症免疫靶向治疗新方法是当前研究的热点,明晰调控关键免疫细胞关键炎症反应的关键分子是脓毒症免疫靶向治疗的抓手。巨噬细胞属于固有免疫细胞,在机体对抗病原微生物感染中发挥重要作用,也将先天性免疫与适应性免疫联系起来。发生脓毒症时,巨噬细胞启动炎症反应的第一步是通过其细胞表面或内部的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）,识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,组装、激活炎症小体,促进成熟的促炎性细胞因子白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）释放,并诱导细胞程序性死亡（焦亡）。近年来的研究发现,巨噬细胞焦亡在脓毒症免疫功能紊乱中发挥关键作用,细胞焦亡极大地促进了细胞因子风暴的形成,导致机体重要脏器的炎性损伤。因此,从临床样本出发,研究巨噬细胞焦亡,抑制巨噬细胞焦亡的相关信号通路,探寻合理有效的调控方案,并明晰其作用机制,是预防与治疗脓毒症的关键所在,具有重要意义和转化应用价值。研究目的研究白细胞分化抗原226（cluster of differentiation 226,CD226）参与脓毒症巨噬细胞焦亡中的作用机制以及靶向干预CD226对脓毒症免疫紊乱和脏器损伤的作用,探索脓毒症免疫靶向治疗的新方法。研究方法收集2018年4月至2018年12月我院急诊重症加强治疗病房脓毒症患者外周血,使用外周血单个核细胞分离技术分离患者血浆及外周血单个核细胞,与健康志愿者标本进行高通量测序,采用生物信息学方法,分析脓毒症患者和健康志愿者之间的基因表达差异。使用火山图、热图、GO富集分析、KEGG富集分析等方法,筛选相关差异基因,选取可能与单核巨噬细胞免疫功能调控有关的关键基因进行下一步实验研究。通过细胞免疫荧光的方式确定人急性单核细胞白血病细胞系（human acute monocytic leukemia cell line,THP-1）CD226分子的表达及位置。构建脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激THP-1细胞模型,模拟脓毒症环境对单核巨噬细胞的作用,检测CD226分子表达与作用持续时间的关系,选取最佳的作用时间。通过小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）的方式抑制CD226分子的表达,并通过实时定量PCR（quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,q PCR）和蛋白质印迹（western blot）实验检测抑制CD226分子后,LPS刺激THP-1细胞后相关炎症因子、焦亡相关转录因子表达情况,以及扫描电镜检验细胞焦亡,以验证CD226分子在巨噬细胞焦亡中的作用及具体机制。利用CD226敲除小鼠,构建盲肠结扎穿刺（cecum ligation and puncture,CLP）脓毒症疾病模型。模型建立成功后通过观察小鼠肺组织苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色评判对脓毒症肺损伤的保护效果;通过肺组织免疫荧光染色观察肺泡巨噬细胞焦亡情况;通过小鼠外周血浆Luminex多因子检测了解细胞因子分泌情况;通过肺巨噬细胞分选,了解CLP模型中巨噬细胞焦亡相关蛋白表达情况。研究结果1.临床患者脓毒症早期外周血单个核细胞测序数据库建立成功,筛选出显著上调差异基因690个,显著下调基因6255个。通过数据分析发现,差异基因的GO功能主要集中在细胞程序性死亡、免疫应答、信号通路转导等3大类功能。KEGG Pathway分析前20大通路主要集中在核糖体功能、DNA复制、T细胞抗原受体（T cell receptor,TCR）通路、细胞内核转录因子（nuclear transcription factor-κB,NF-k B）通路等,其中CD226在脓毒症患者早期免疫细胞功能调节、细胞程序性死亡、对刺激的反应以及压力应激等生物功能中发挥重要作用,需要我们进一步研究2.免疫荧光发现THP-1细胞表达CD226分子,且主要在细胞膜上表达。进一步建立LPS刺激THP-1细胞模型,发现CD226表达水平与LPS刺激时间存在时间依赖曲线,LPS刺激12 h CD226明显上升。通过si RNA的方式抑制CD226表达,发现抑制CD226表达确实可以减少促炎细胞因子分泌,尤其是对IL-1β的抑制效果更明显。进一步研究发现抑制CD226分子减少含NLR家族PYRIN域蛋白3（recombinant NLR family,pyrin domain containing protein 3,NLRP3）的表达,扫描电镜提示抑制CD226分子表达后,细胞膜打孔现象明显减少,提示CD226分子可能通过NLRP3/IL-1β途径调控巨噬细胞焦亡。3.为了验证靶向CD226分子表达对于脓毒症的临床治疗是否有效,我们采用CD226敲除（CD226 knockout,CD226 KO）小鼠,构建CLP脓毒症模型,结果发现,CD226KO小鼠急性肺损伤明显减轻,巨噬细胞焦亡现象较野生型小鼠明显减少,CD226KO小鼠血清促炎细胞因子IL-1β、干扰素-γ（interferonγ,IFN-γ）水平明显下降,促炎因子IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平有所下降,而抑炎细胞因子IL-10、IL-4、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）无明显变化。进一步分选肺巨噬细胞进行Western-Blot实验,发现CD226KO组小鼠焦亡相关蛋白表达明显下调。研究结论1.脓毒症患者早期外周血单个核细胞测序数据库建立成功,CD226分子表达明显增高且与多个炎症细胞调控通路有关。2.CD226分子通过NLRP3/IL-1β通路调控巨噬细胞焦亡,促进促炎细胞因子的分泌。3.敲除CD226分子抑制肺泡巨噬细胞焦亡,抑制促炎细胞因子释放,减轻脓毒症肺损伤,CD226分子可以作为脓毒症免疫靶向治疗新的靶点。