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目的: 组织或器官微细结构的三维重建以其直观性给传统的形态学研究方法带来了革新。这种方法使用先进的显微镜配上高分辨率图像采集系统,加上大存储量、高运算速度的计算机;结合免疫组化等生物样本制作技术,使得微细结构三维重建的信息更加丰富,研究效率更高。本方法在结构三维可视化、形态信息丰富、细胞活动定位准确等方面具有传统形态学研究无可比拟的优势。 文献报道已有基于Linux平台,对100万像素水平的连续显微切片图像进行配准,并配合人工追踪程序标记肾小管位置,最终显示部分肾小管的立体结构模型;这些已经发表的成果在小鼠肾的功能、特定蛋白定位及肾脏发育过程研究中发挥了重要作用。但随研究深入,对连续切片图像的分辨率、被追踪小管的数量和精度、以及显示效果等都提出了更高要求。 本研究通过生物医学工程中的图像配准、区域分割、目标提取和追踪、三维重建等方法,建立小鼠肾小管的微细结构模型并通过计算机进行可视化分析。重点解决:(1)任意旋转角度和摆放位置的8000万像素水平显微图像配准;(2)序列图像中图像间染色不均一的自动校正算法;(3)显微切片的目标追踪和器官中复杂空间结构分析问题。 本文选择胚龄为14d和17d的胎鼠,和生后1d、3d、5d、7d和10d的仔鼠和一只成年昆明鼠的肾脏,建立了X-Y分辨力0.23μm/pixel,Z分辨力2.5μm,可覆盖全部截面的连续光学显微切片图片集;并通过本文提出的方法完成配准、颜色校正和部分肾小管的追踪,建立了KM小鼠肾发育过程的三维空间结构模型,空间位置相对误差<2%;本文还开发了基于DirectX技术实时交互式的小鼠肾小管三维模型浏览与分析软件。 本文的结果为肾脏复杂空间结构分析提供了方法,并以形态学的视角揭示肾脏发生发育过程;最终目标是结合核酸检测和蛋白定位技术等方法,为小鼠肾小管发生发育过程中细胞增殖、迁移、分化、凋亡等的时空变化规律进行探索。在组织学与胚胎学、生理学和发育生物学的研究中具有科学意义和应用价值。 实验方法: 一、方向梯度直方图优化高分辨率连续显微切片配准 “列文伯格-马奎斯特”算法(以下简称LM算法)是图像配准中常用的搜索算法,但容易陷入局部极值,造成配准错误。但只有严格精确的配准对高分辨率图像才有意义。论文第一部分针对高分辨率连续切片图像的特点,设计配准方法: 首先利用“方向梯度直方图”算法快速获得图像的旋转角度参数,这个步骤可以看成是“粗配准”。接下来将图像的灰度作为特征,均方差作为“相似性测度”,使用“双三次插值”算法,“LM”搜索算法和“金字塔”优化算法,将两幅图像进行精确配准。 在连续图像配准阶段,为避免因切片轻微形变带来的累积误差,本文设计图像“骨架配准”算法进行连续图像配准。 二、连续显微切片图像的亮度补偿与对比增强 自动追踪或基于灰度的三维重建都需要连续图像中的各个图像灰度一致,但切片制作由手工完成,很难保证染色一致性。已有灰度恢复算法又因连续切片跨度大,图像内容变化明显而无法准确还原图像。 本研究第二部分设计了“序列灰度直方图拟合”算法(以下简称“SHFA”算法)。算法首先分析序列图像中每一张图像的“灰度直方图”,并设置关键点;然后对四次曲线“拟合”算法,对这些关键点拟合以得到变化趋势;接下来利用拟合后的关键点恢复目地直方图;最后采用“直方图规定化”,进行亮度补偿和对比增强。 三、肾小管自动追踪 本研究第三部分首先设计了基于Windows平台的肾小管手工追踪程序。 在自动跟踪部分我们首先提取肾小管的特征点,然后对相邻图像的特征点进行匹配,进而还原整个肾小管的三维结构,具体过程如下:首先基于“尺度不变特征变换”(以下简称“SIFT”算法),对相邻的两幅已配准图片提取肾小管的关键点和关键点属性;并在相邻图像的邻域内进行关键点匹配;然后使用“随机抽样一致”(以下简称“RANSAC”算法),对已匹配关键点进行“一致性提纯”,删除错误匹配点;接下来进行关键点连通性检测,判断两关键点是否是同一肾小管,若是则建立同平面的连接关系;最后序列图像特征点匹配,显示肾小管原本的折返、分支等结构,删除过短的肾小管连接。 四、肾小管微细结构可视化 基于“.NET平台”和“DirectX”技术,建立交互式的肾小管三维可视化软件。 结果: 一、方向梯度直方图优化高分辨率连续显微切片配准 选取胚龄为14d和17d的胎鼠,和生后1d、3d、5d、7d和10d的仔鼠和一只成年昆明鼠的肾脏;取材并采用标准的多聚甲醛固定与树脂包埋技术,或戊二醛固定与石蜡包埋技术制作切片;甲苯胺蓝或苏木精染色;通过“病理切片扫描仪”获取图像,建立了X-Y分辨力0.23μm/pixel,Z分辨力2.5μm,时间分辨率为2d的小鼠肾发育过程光学显微图片集共10组,5891张,1200GB。 通过对10组图片集测试:两幅图像配准中,其中方向梯度直方图算法在处理方向性明显的图片的有效率约98%,对近乎圆形组织切片图像的有效率最低组约为85%;优化后的LM算法配准正确率为90-98%,运算速度提高约30%-65%。 骨架算法中,骨架图像的间距为1-5张,测试表明可对超过95%的图像获得最佳配准效果;骨架算法可以有效地避免因切片皱褶、形变、破损而带来的累积误差,提高序列图像的配准精度。10组图像均由骨架配准算法进行连续图像配准,全部有效。 二、连续显微切片图像的亮度补偿与对比增强 本文设计的SHFA算法可以自动的对连续显微图像进行亮度补偿与对比增强,算法处理时考虑了图片所包含的信息,因此在图片全局的亮度补偿与对比增强的同时,图片暗部和亮部细节仍然保留。 三、肾小管自动追踪算法 肾小管自动追踪算法可以对肾小管进行检测。通过调整SIFT算法中的模糊系数,可选择检测尺度,以适应不同断面的小管大小。各断面肾小管的综合检测准确率>95%。临近图像的关键点的匹配正确率在98%所有。 本文目前测试了成年小鼠肾图片集中25-300号切片的自动跟踪效果,每切片的关键点检测数在2500-5000点,最终选取长度在20个节点以上的肾小管最为阈值,共检测到肾小管1521条。最终绘制的肾小管自动检测接过约50万节点。 四、肾小管微细结构可视化方法 基于DirectX技术的肾小管微细结构可视化方法,已经测试的50万节点水平的肾小管结构,可以实时显示,CPU占用率不超过5%,小管结构中的前后毗邻(绘图时的遮挡)关系表现准确,三维空间点的拾取准确,标注等附加功能基本完善。 结论: 本文提出的方法可以完成连续光学显微图像配准;对序列图片间染色不均一造成的色彩差异进行校正,同时进行对比增强;并对肾小管进行自动追踪和三维可视化。为肾的微细结构研究和类似的管状结构形态(如神经、血管、气管的分支)等的研究提供了方法。