新型鹅星状病毒（Novel Goose Astrovirus,N-GAstV）是近年来一种新出现的致病病毒,可引起5～20日龄雏鹅的多个器官出现尿酸盐沉积的病变特征,具有高度传染性和高死亡率,给我国鹅业造成了严重的经济损失。因此,加强对新型鹅星状病毒病原及快速检测方法的研究,对防控新型鹅星状病毒病,保护和促进我国养鹅业的可持续发展具有重要意义。目前已建立了检测N-GAstV的RT-PCR、RT-q PCR和LAMP等方法,但是这些方法均需要特殊仪器辅助。胶体金层析检测方法具有简便快速、适合现场检测和不需特殊实验仪器等优点,广泛应用于疫病诊断中。本研究成功分离了7株新型鹅星状病毒,制备了抗新型鹅星状病毒的单克隆抗体和多克隆抗体,并以此为基础建立了针对新型鹅星状病毒的胶体金层析检测方法,可以为防控和快速诊断NGAstV提供了一定的技术支撑。本研究的内容如下:1、N-GAstV分离鉴定与遗传变异分析:为了解国内新型鹅星状病毒的变异情况,本研究于2019～2021年采集了我国9个省份30份不同日龄的鹅病料。剖检显示,内脏器官均有尿酸盐沉积的病变特征。对采集的样品进行PCR检测,均检测出N-GAstV,采用鸡胚肝细胞（CEL）对阳性样品进行病毒分离,共分离得到7株新型鹅星状病毒毒株。同源性比对和遗传进化分析结果显示,7株病毒分离株ORF2基因核苷酸同源性在97.9%～99.7%之间,分离株之间差异性不大。病毒分离株与N-GAstV SDPY株ORF2基因核苷酸同源性在98.4%～99.5%之间,氨基酸同源性在98.0%～99.0%之间,并在进化树的同一分支上,亲缘关系较近,表明近年来N-GAstV未发生明显变异。病毒分离株与鹅源、鸡源、鸭源和火鸡源Ast V标准株ORF2基因核苷酸同源性均较低。其中与GAstV FLX株同源性在42.6%～42.8%之间;与DAst V YP2株同源性在38.2%～38.7%之间;与TAst V MO/01同源性在38.2%～38.7%之间;与CAst V 4175同源性在37.0%～38.4%之间,同源性最低、亲缘关系最远。并且分离株与鹅源、鸡源、火鸡源和鸭源Ast V均位于不同进化树分支上,亲缘关系较远。本研究选取与N-GAstV SDPY株ORF2基因组序列同源性最高,与其他禽源Ast V同源性均较低的SDWF0601分离株作为实验毒株,提取病毒核酸,扩增ORF2目的基因片段。2、N-GAstV ORF2单克隆抗体和多克隆抗体的制备:根据已发表的N-GAstV ORF2基因组序列,设计引物,构建新型鹅星状病毒ORF2重组表达载体,原核表达ORF2蛋白,免疫6～7周龄的BALB/c小鼠,制备脾细胞,经与SP2/0融合、筛选和亚克隆,获得一株能够稳定分泌单抗的杂交瘤细胞,通过诱导小鼠产腹水的方法大量获得单克隆抗体,经鉴定单克隆抗体的亚型为Ig G2a,抗体滴度为1:51200,IFA、WB和间接ELISA鉴定表明该单克隆抗体具有良好的反应活性。将制备的ORF2蛋白与弗氏佐剂和弗氏不完全佐剂混和后免疫新西兰大耳兔,4次免疫后采血制备多克隆抗体,纯化后的抗体滴度为1:102400,IFA和WB鉴定表明该多克隆抗体具有良好的反应活性。3、胶体金层析检测方法的建立:本研究经柠檬酸三钠还原氯金酸制备金溶液,制备的胶体金颜色清亮、均一。对各条件优化,胶体金与单抗最佳结合浓度为6μg/m L,最佳结合p H为p H 8.0,最佳免疫胶体金重悬稀释液为含有1%蔗糖和1%BSA的0.01mol/L Tris-Cl。以制备的单克隆抗体作为金标抗体,多克隆抗体作为包被抗体,建立胶体金层析方法检测N-GAstV。对各条件优化,胶体金试纸条T线和C线抗体最佳包被浓度为1.6 mg/m L,最佳包被液为PBS。试纸条灵敏性试验结果显示,该方法最低检出病毒量为1.2μg/m L,PCR为0.12μg/m L,灵敏性相近;特异性试验结果显示,除NGAstV检测结果为阳性外,常见禽源病原DAst V、GPV、H9-AIV、FAd V-4、DHAV-3和TMUV检测结果均呈阴性,无交叉反应;重复性试验结果显示,使用不同批次的试纸条均能检测出病毒;临床样品检测试验结果显示,该试纸条可检出37份阳性样品,与PCR方法的符合率为92.5%。稳定性试验结果显示,在25℃室温下试纸条可稳定保存3个月,4℃下可稳定保存5个月。并且该方法反应时间短,可在10 min内出现结果。胶体金层析检测方法可作为一种简便、快速、灵敏、特异检测新型鹅星状病毒的方法。