[研究背景及目的]回归热是由回归热疏螺旋体感染引起的一种多系统性疾病,除表现为菌血症和反复发热外,还可以引起中枢神经系统疾病。回归热疏螺旋体病的神经性症状类似于感冒,诊断时容易与病毒性感冒混淆,导致延误治疗而造成严重的后果。然而,由于疾病模型的缺乏,回归热螺旋体感染引起的中枢神经系统疾病的机制还不是很清楚。我们的前期研究通过建立回归热中枢神经系统疾病小鼠模型,发现了T淋巴细胞在该疾病模型中起关键性的作用。另外,该疾病综合征可以自然康复。基于我们的前期研究基础和动物模型,本研究将进一步阐.明其致病机制和自然康复机制,主要包括以下三个主要内容:1)确定回归热疏螺旋体感染对血脑屏障的影响;2)探索在回归热疏螺旋体神经性病模型IL-17信号的致病作用;3)确定回归热中枢神经系统疾病过程中宿主因素与自然康复的关系,探索该疾病自然康复的可能机制。[方法]首先制备回归热疏螺旋体的活的、灭活的和裂解的形式,以及它们刺激外周血和脾脏淋巴细胞获得的条件性培养基,并分别用这些形式的菌体和条件性培养基刺激小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd3),通过酶标仪检测细胞内自由基(ROS)和线粒体体损伤的情况,并利用Western Blot检测细胞内紧密连接蛋白ZO-1的蛋白水平的变化。然后,利用人和小鼠的血管内皮细胞构建脑微血管模型,通过荧光素钠检测刺激前后通透性的变化。接着,通过比较回归热螺旋体感染野生型C57BL/6小鼠和IL-17A基因缺失小鼠后的菌血症、细胞因子和神经症状的情况,探索IL-17信号在该疾病模型中的作用。最后,比较了 C57BL/6、Balb/c和ICR三种小鼠在感染回归热螺旋体后菌血症、抗体和神经症状的差别。通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光等方法分析了螺旋体及相应条件培养基体外小胶质细胞(BV-2)后,细胞内IDO的mRNA水平和蛋白水平的变化。[结果]小鼠脑微血管内皮细胞体外刺激实验结果表明,回归热螺旋体处理可以刺激脑微血管细胞产生大量自由基,并引起线粒体损伤。Western Blot分析表明,3种形式的菌体刺激均导致了血管内皮细胞的ZO-1蛋白表达下降。脑微血管通透性模型研究表明,回归热螺旋体的刺激可以显著增加血管模型的通透性。为了确定IL-17信号在回归热螺旋体神经性致病性中的作用,本论文比较了C57BL/6和IL17A-/-小鼠感染回归热螺旋体后的情况,结果发现IL17A-/-小鼠在21d实验周期中,只出现了菌血症而无中枢神经症状,相比之下,野生型C57BL/6小鼠的菌血症和中枢神经症状均很明显。不同遗传背景小鼠的感染回归热螺旋体实验显示,不同的遗传背景引起的神经症状有着较大差别,C57BL/6小鼠菌血症明显,且呈现回归反复形式,中枢神经症状也很明显;而Balb/c和ICR两种遗传背景小鼠虽然菌血症明显,但是基本无中枢神经症状。另外,对比三种小鼠血清中螺旋体特异性的抗体水平发现,3种小鼠的IgG水平无明显差异,C57BL/6小鼠的IgM水平呈现反复回归变化,而Balb/c和ICR小鼠IgM水平呈现逐渐升高。小胶质细胞的体外刺激实验表明,菌体三种形式和条件培养基的刺激诱导了细胞内IDO mRNA表达水平升高。Western Blot分析也显示,BV-2细胞经刺激后的24h和48h,胞内IDO蛋白表达水平也增加,细胞免疫荧光检测确认了这一结果。[结论]回归热螺旋体刺激脑微血管内皮细胞后,诱导胞内产生大量自由基,并且可以引起胞内线粒体损伤和降低ZO-1蛋白的表达,从而导致了血脑屏障通透性的增加。IL-17信号在回归热螺旋体感染引起的中枢神经系统疾病中可能起着非常重要的作用。回归热螺旋体感染引起小胶质细胞内IDO的mRNA水平和蛋白水平的增加,可能是该疾病模型后期神经症状减轻或消失的一个因素。最后,宿主的遗传背景也可能是感染回归热螺旋体后神经症状减轻或消失的一方面原因。