SBE2B基因的克隆、表达载体的构建及水稻遗传转化体系的建立

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水稻(Oryza sativa L)是重要的粮食作物之一,据估计世界上大约有一半以上的人口以稻米为主食。在我国,水稻年播种面积在3000万公顷以上,其中杂交稻的播种面积占到50%左右,部分省市如四川、江西杂交稻占90%以上。然而,在杂交稻中许多品种存在品质不优的问题,尤其是直链淀粉含量太高,其蒸煮品质上表现为粘性小,硬度大,口感不好等问题,采用常规育种的方法虽然取得了一些进展,但进程太慢,效果不理想。植物生物技术的出现和运用,无疑为我们通过分子生物学的方法解决水稻的品质问题提供了极大的帮助。 本研究从授粉15天左右的玉米胚乳中提取了总RNA,采用RT-PCR方法,克隆了玉米胚乳的淀粉分支酶基因sbe2b,测序结果表明,玉米胚乳sbe2b的cDNA全长为2.4kb,编码800个氨基酸,推测的氨基酸的分子量为93000D,该序列与GenBank中登录号为AF072725的玉米sbe2b的cDNA序列有98%的同源性,与水稻、大麦、小麦等禾本科植物的有关淀粉分支酶的DNA序列都有极高的同源性。 构建了无选择标记的sbe2b基因的表达载体,该质粒大小为6.06kb,含有胚乳特异启动子,在该启动子的内部含有一个内含子,可在植物组织特异部位进行表达。正向连接的表达载体用于增加胚乳中支链淀粉的含量,反向连接用于减少胚乳中支链淀粉的含量,增加直链淀粉的含量。 在水稻的遗传转化过程中,通过基因枪法将含有目的基因sbe2b的质粒载体pEBE2和含有筛选标记基因bar的质粒载体35SIH3共转化到蜀恢527、明恢86、612S等籼稻品种中去。通过除草剂筛选培养获得了抗性愈伤组织,在合适的分化培养基中得到了对除草剂有抗性的小苗。 运用农杆菌转化法将含有bar基因的质粒pSHK22转化到粳稻品种中花11号,通过两次除草剂抗性筛选,已经获得了大量的抗性愈伤组织,有待进一步分化出苗,建立水稻的突变体库。
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