目的:鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci,Cps）为专性胞内寄生的病原菌,感染后可引起肺炎、脑炎等疾病。包涵体膜蛋白（Inclusion membrane protein,Inc）是由衣原体分泌并定位于包涵体膜,在包涵体膜结构和稳定性及病原体与宿主相互作用中发挥重要功能的一系列蛋白质。Inc在衣原体的生长发育及致病中具有重要作用,但目前对Cps Inc了解甚少。本研究拟采用生物信息学方法对Cps Inc进行预测,采用IFA确定预测蛋白的亚细胞定位,并进一步对定位于包涵体膜上的蛋白的表达时相及其基本功能进行探究。进而为阐明Cps致病机制提供新的依据。方法:根据Inc的特征性双叶疏水结构域,采用生物信息学方法Kyte-Doolittle算法分析Cps 6BC氨基酸序列,同时采用TMHMM辅助分析该结构域。根据预测蛋白的基因序列设计特异性引物,以Cps6BC基因组DNA为模板进行PCR扩增,酶切后与p GEX-6p-1或p ET-28a（+）质粒连接,构建原核表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,增菌培养并加IPTG诱导重组蛋白表达。确定最佳诱导条件后,大量诱导重组蛋白表达,并用GST结合树脂和Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。BCA法测定蛋白浓度,100μg/m L多粘菌素B去内毒素后,以50μg重组蛋白/只免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,眼眶取血制备抗血清。以制备的多克隆抗体为一抗进行IFA分析以确定蛋白的亚细胞定位。收集不同时间点感染细胞进行IFA、q RT-PCR和WB分析确定蛋白的表达时相。以10μg/m L去内毒素重组蛋白刺激THP-1细胞24 h,收集细胞进行q RT-PCR检测促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的m RNA水平以确定这些重组蛋白是否会引起细胞炎症反应。以不同浓度重组蛋白刺激THP-1细胞相应时间点或以相同浓度重组蛋白刺激THP-1细胞不同时间点,收集细胞及培养上清分别进行q RT-PCR和ELISA分析,以确定重组蛋白刺激浓度和刺激时间对促炎性细胞因子表达的影响。重组蛋白刺激THP-1细胞0、15、30、60、120、180 min后,收集细胞提取总蛋白,WB检测MAPKs分子p38激酶、JNK、ERK以及NF-κB抑制分子I-κBα的磷酸化水平,重组蛋白刺激细胞6 h后,收集细胞进行IFA检测NF-κB p65亚基的核转位,以确定是否有MAPKs分子和NF-κB的激活;p38激酶、JNK、ERK以及I-κBα抑制剂预处理THP-1细胞30 min后,用重组蛋白进行刺激,收集细胞及培养上清分别进行q RT-PCR和ELISA分析以确定这些抑制剂是否会影响促炎性细胞因子的表达,从而进一步证实MAPK通路及NF-κB通路对重组蛋白诱导的炎性细胞因子表达的影响。转染TLR2、TLR4、TLR6及对照干扰片段,My D88及对照干扰质粒后,重组蛋白刺激转染后细胞,收集细胞及培养上清分别进行q RT-PCR和ELISA分析以确定TLR受体及其衔接分子My D88在促炎性细胞因子表达中的作用。结果:（1）根据生物信息学方法,本研究选取了CPSIT₀201、CPSIT₀289、CPSIT₀321、CPSIT₀350、CPSIT₀357、CPSIT₀432、CPSIT₀532、CPSIT₀555、CPSIT₀556、CPSIT₀607、CPSIT₀842作为预测蛋白;（2）根据这些蛋白的核苷酸序列设计特异性引物,利用这些引物扩增出了Cps 6BC基因组中目的片段,经RCR检测显示这些目的片段成功插入了质粒载体中,且重组质粒测序结果与NCBI上公布的核苷酸序列完全一致,证实这些蛋白的原核表达载体构建成功;（3）加诱导剂IPTG诱导重组蛋白表达,有6种p GEX-6p-1表达载体成功诱导表达出了重组蛋白,两种p ET-28a/末端基因片段重组载体表达了蛋白,且均能在上清中被检测到,并用GST结合树脂和Ni-NTA树脂对重组蛋白进行纯化。纯化的蛋白以GST单克隆抗体和His单克隆抗体为一抗进行WB分析,检测出了明显的条带;（4）IFA观察结果显示CPSIT₀289、CPSIT₀357、CPSIT₀432、CPSIT₀607定位于包涵体膜内,CPSIT₀556和CPSIT₀842定位于包涵体膜上;（5）IFA结果显示在感染后18 h即能观察到CPSIT₀556和CPSIT₀842的表达,其定位于包涵体膜,并在随后整个感染周期中持续定位于包涵体膜;q RT-PCR结果表明,CPSIT₀556和CPSIT₀842的转录水平分别在感染后12 h和6 h达峰值;CPSIT₀556在感染后12 h可检测到蛋白的表达,而CPSIT₀842于感染后6 h即可检测到蛋白的表达。（6）CPSIT₀556和CPSIT₀842可诱导THP-1细胞表达IL-6和IL-8,并且CPSIT₀556刺激IL-6和IL-8的表达的最佳浓度为15μg/m L,最佳时间为18 h,CPSIT₀842的最佳刺激浓度为10μg/m L,最佳刺激时间为24 h;（7）CPSIT₀556和CPSIT₀842刺激后,p38激酶、JNK、ERK和I-κBα分子可发生磷酸化,NF-κB p65亚基核转位显著增加;经p38激酶、JNK、ERK和I-κBα抑制剂预处理后,IL-6和IL-8的表达水平显著下降;（8）THP-1细胞转染My D88干扰质粒后,CPSIT₀556和CPSIT₀842诱导的IL-6和IL-8的表达水平显著下降;经TLR4干扰片段干扰后,CPSIT₀556诱导的IL-6和IL-8的表达下降,而TLR2和TLR4均可影响CPSIT₀842对IL-6和IL-8的诱导表达。结论:1、CPSIT₀289、CPSIT₀357、CPSIT₀432、CPSIT₀607定位于包涵体膜内,CPSIT₀556和CPSIT₀842定位于包涵体膜,且CPSIT₀556为Cps中期表达蛋白,CPSIT₀842为Cps早期表达蛋白。2、CPSIT₀556可经TLR4/My D88通路及MAPKs和NF-κB途径诱导THP-1细胞中IL-6和IL-8的表达;而CPSIT₀842可同时被TLR2和TLR4识别,同时也能通过MAPKs和NF-κB通路诱导THP-1细胞产生IL-6和IL-8。