蚊媒传播的疟疾是一种危害严重的传染病,在全世界人群中具有很高的发病率和致死率。随着疟原虫多药抗性株的出现与迅速扩散、以及蚊媒对杀虫剂耐受性的增加,目前又无有效的抗疟疫苗。因此,疟疾控制工作将面临巨大的挑战,迫切需要发展新的疟疾控制策略。于上世纪九十年代,WHO提出了基因操纵蚊媒的新策略,而寻找支持或抑制疟原虫在蚊体内发育的相关基因,克隆、鉴定及分析其功能,以及研究按蚊抗疟原虫感染的先天性免疫反应机制是实现这一策略的重要前提。卵囊黑化包被反应是按蚊抵御疟原虫感染的特异性免疫防御机制,也是抗性株冈比亚按蚊或不易感按蚊的最主要表型。而前酚氧化酶(Prophenoloxidase,PPO)是介导卵囊黑化包被反应的一种关键酶,活化后可催化酪氨酸羟基化为二羟基苯基丙氨酸,二羟基苯基丙氨酸和多巴胺可进一步氧化为具有活性的苯醌活性,苯醌即可介导蛋白交联并聚合成黑色素层固定、隔离或杀死入侵的病原体。由于PPO级联反应介导的黑化现象在按蚊及昆虫中非常普遍,除包被的入侵病原体外、还包括卵壳和几丁质的硬化与色素沉积,以及创伤愈合等。因此,据黑化反应的多种功能提示在按蚊及昆虫基因组中可能拥有大量的PPO基因。目前,已从冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)克隆到6种不同的PPO基因,但斯氏按蚊(Anopheles stephensi)与库态按蚊(Anopheles culicifacies)仅克隆到一种,并对其在按蚊抗疟原虫感染中的作用进行了初步研究。大劣按蚊(Anopheles dirus)是我国和东南亚地区的重要传疟蚊媒,为恶性疟原虫的易感蚊种,但可黑化包被中肠内发育的约氏疟原虫卵囊并表现出抗性。目前,有关大劣按蚊种传播恶性疟原虫相关的研究较多,但对其抵御疟原虫感染的先天性免疫防御机制的研究较少,如黑化包被约氏疟原虫卵囊。因此,本课题拟主要进行以下几方面的基础研究工作:一、大劣按蚊PPO基因的cDNA克隆与序列分析。二、吸血与约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO基因转录的影响。三、约氏疟原虫感染斯氏与大劣按蚊前后其中肠内PPO的变化。其实验内容和结果主要包括以下三个方面:1.根据冈比亚按蚊、烟草天蛾和天蚕等9种已知昆虫PPO的保守氨基酸序列设计<WP=12>简并引物,以大劣按蚊2-3龄幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增后获得一条约600bp的条带。将该片段切胶回收、纯化后与pMD18 T-载体连接,转化至XL1-Blue菌株(用CaCl2法制备感受态细菌),在含氨苄青霉素的LB平板上共获得近70个白斑菌落。随机挑取单个白斑菌落进行培养并抽提质粒,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后可见切下一条略大于600bp的DNA片段。再以10倍稀释经双酶切鉴定为阳性克隆的质粒为模板,利用PPO简并引物经PCR扩增后仍获得一条约600bp的条带,与以cDNA为模板扩增出的条带大小一致。测定阳性克隆质粒内插入的序列为597bp,用DNASIS程序推导目的片段的氨基酸序列,序列两端分别为PPO的两个铜结合位点:CuA:HHWHWHLVYP;CuB:MRDPAFYRWH。由于该两个结合位点的氨基酸序列在各种昆虫PPO中均具有高度的保守性,也是PPO的重要标记,表明克隆所得的片段为大劣按蚊PPO基因的部分序列。根据已获得的PPO基因序列设计一条特异上游引物,再结合按蚊及多种昆虫PPO 3′-端的保守氨基酸序列设计另一条简并下游引物,经RT-PCR及TA克隆后获得一条1163bp的片段,其中5′-端有431bp与已克隆PPO基因3′-端序列基本一致(429/431),表明该序列与已克隆大劣按蚊PPO基因序列为同一基因序列。将2条序列进行拼接后获得的PPO基因序列长为1329bp,推导可编码443个氨基酸残基。Blast查询结果显示,克隆的大劣按蚊PPO基因序列与冈比亚按蚊PPO4基因序列的同源性达84%(1113/1325),氨基酸序列的同源性为91%(406/443aa)。由于与冈比亚按蚊PPO4基因序列具有很高的同源性,因此命名为AdPPO4,已提交GeneBank数据库(Access Number:AY347484)。2.根据已克隆AdPPO4基因序列设计特异引物,利用半定量RT-PCR分析吸血与约氏疟原虫感染对其转录的影响,并对AdPPO4在蚊各发育虫期中的转录,以及成蚊血淋巴、中肠与唾液腺组织中的转录进行了研究。结果显示AdPPO4在蚊幼虫与蛹期呈现高丰度转录;成蚊血细胞也可转录AdPPO4,而中肠与唾液腺组织不转录或极低水平转录。成蚊中AdPPO4的转录水平较低,但吸血或吸血感染约氏疟原虫后转录明显增强,提示吸血或吸血感染约氏疟原虫时可诱导AdPPO4基因转录增加。由于大劣按蚊可黑化包被中肠内发育的约氏疟原虫卵囊,而PPO是介导卵囊黑化的一种关键酶,因此成蚊中AdPPO4基因的表达增加可有助于黑化包被约氏疟原虫卵囊,但AdPPO4在卵囊黑化包被中的作用及其具体机制还需要进一步研究。3.按蚊中肠既是一个重要的免疫效应器官,也是PPO介导疟原虫卵囊黑化包被反应的场所。利用美国Oklahoma州立大学Dr. Jiang惠赠的PPO多抗,结合免疫组化与免<WP=13>疫印迹技术,检测斯氏与大劣按蚊在吸血感染约氏疟原虫前后其中肠内PPO的变化。发现斯氏与大劣按蚊在吸血感染前后其中肠内PPO的分布明显不同,感染前PPO主要分布于中肠循环管道内,而感染后PPO聚集于中肠组织细胞间隙之间,表明按蚊吸血感染疟原虫后可导致存在于中肠循环管道内PPO聚集于组织间隙。由于感染后同时间点大劣按蚊中肠内PPO的聚集程度大于