【摘 要】
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目的： 1.探究治疗二型糖尿病的常用药物二甲双胍（metformin）对肿瘤细胞增殖的影响及其相关的分子机制,初步弄清其用于治疗肿瘤的理论基础； 2.探索AMPK在metformin调控肿瘤细胞增殖过程中的作用及其作用机制； 3.研究AMPK调控组蛋白翻译后修饰,如H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的机制及AMPK修饰OGT的具体机制及对OGT亚细胞定位,生物学
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目的： 1.探究治疗二型糖尿病的常用药物二甲双胍（metformin）对肿瘤细胞增殖的影响及其相关的分子机制,初步弄清其用于治疗肿瘤的理论基础； 2.探索AMPK在metformin调控肿瘤细胞增殖过程中的作用及其作用机制； 3.研究AMPK调控组蛋白翻译后修饰,如H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的机制及AMPK修饰OGT的具体机制及对OGT亚细胞定位,生物学功能的影响； 4.探索OGT反馈性修饰AMPK机制及其对AMPK 方法： 1.用不同浓度的metformin处理T47D细胞株24小时或者用同一浓度（8mmM）处理T47D细胞不同时间,用细胞计数仪检测metformin对细胞生长的影响,用流式细胞技术分析细胞周期变化情况。同时用Western检测细胞内AMPK的激活情况及组蛋白H28120位的单泛素化修饰及下游基因的转录水平。用siRNA特异敲低AMPKal,检测metformin对于T47D细胞的抑制作用是否依赖于AMPK。 2.用不同的AMPK的激活剂和抑制剂刺激肿瘤细胞,AMPK-/-或AMPK+/+MEF细胞观察H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的水平变化,明确AMPK在H2B K120ub, H2BS112GlcNAc的作用； 3.采用质谱学方法,免疫共沉淀方法,体外激酶实验,放射自显影等方法明确AMPK与OGT的相互作用关系,并确定AMPK磷酸化OGT的位点并证实AMPK对OGT的磷酸化与否决定了AMPK是否调节H2B K120ub, H2B S112GlcNAc的水平变化； 4.通过体外糖基化反应,染色质抽提,ChlP-qPCR等方法证实AMPK磷酸化修饰OGT影响了OGT的亚细胞定位但并不影响OGT的糖基转移酶活性,而OGT同样可以反馈性的糖基化修饰AMPK并影响其激酶活性,同时通过油红O染色来观察OGT糖基化修饰AMPK后对AMPK下游成脂代谢的影响； 结果： 1. Metformin处理可以抑制H2B K120ub的水平,并呈AMPK依赖性,AMPK可以抑制H2BS112O-Glc, H2BK120ub及其下游基因转录； 2. AMPK与OGT相互作用,并磷酸化修饰OGT,修饰位点为T444； 3. AMPK通过磷酸化修饰OGT抑制了染色质对OGT的招募,使细胞核中OGT的水平降低,但并不影响OGT的糖基转移酶活性； 4. AMPK通过磷酸化修饰OGT参与组蛋白的翻译后修饰并影响其下游基因转录水平； 5.OGT反馈性糖基化修饰AMPK并抑制其激酶活性； 结论： 1. Metformin抑制肿瘤生长的原因包含激活AMPK后磷酸化修饰OGT,抑制OGT在染色质的聚集,从而抑制H2BS112位点糖基化修饰等一系列组蛋白翻译后修饰,并影响下游基因转录水平,从而影响肿瘤细胞周期,细胞增殖； 2. AMPK磷酸化OGT的位点为T444,该位点在多数动物中为保守位点,从而影响OGT的亚细胞定位来调节OGT的功能,但对OGT的糖基转移酶活性并无影响； 3. OGT可以反馈性的糖基化修饰AMPK并抑制AMPK的激酶活性,并影响其下游蛋白的磷酸化修饰；
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