论文部分内容阅读
研究背景:胶质母细胞瘤是临床常见的中枢神经系统恶性肿瘤,它约占中枢神经系统恶性肿瘤的50%左右,目前胶质母细胞瘤的治疗方式以放疗、化疗和手术治疗为主。尽管近年来医学技术发展迅速,但胶质母细胞瘤预后效果仍然不容乐观。因此,深入探索胶质母细胞瘤发生发展的分子机制,研究有效的治疗靶点,对提高胶质母细胞瘤患者的治疗效果至关重要。TRIM（tripartite motif）家族蛋白在人体生理活动中起着重要作用。其蛋白结构高度保守,从N端到C端依次是RING结构域（RING domain）、B-box结构域（B-box domain）、卷曲螺旋结构域（Coiled-coil domain）。最初研究发现,TRIM家族蛋白广泛参与增殖、分化、程序性死亡等多种细胞活动,影响细胞的信号转导以及参与固有免疫等重要活动。近年来研究表明,TRIM家族蛋白在肿瘤的发生发展中可能起着重要作用。但目前关于TRIM38在胶质母细胞瘤中的表达、功能、分子机制及临床意义尚不清楚,需进一步研究阐述。本研究旨在明确TRIM38在胶质母细胞瘤中的表达与患者生存期的相关性、以及TRIM38对胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性表型的具体作用,并对其分子机制进行研究,意图揭示TRIM38对胶质母细胞瘤生物学特征的影响,为胶质母细胞瘤的精准治疗提供新的靶点。研究方法:1.首先在RAUH、TCGA、GSE60274、GSE63347数据库中分析TRIM38非CpG岛DNA甲基化位点在正常样本和胶质母细胞瘤样本中的变化情况,其次在人脑胶质母细胞瘤细胞系中检测TRIM38的DNA甲基化程度,最后用Pearson关联分析评估TRIM38基因甲基化与基因表达之间的关联程度;2.利用GSE16011、CGGA、REMBRANDT数据库和免疫组化分析TRIM38在不同病理级别的胶质母细胞瘤中的表达情况,其次在不同的人脑胶质母细胞瘤细胞系中检测TRIM38的表达情况;最后在不同数据库中分析TRIM38表达与胶质母细胞瘤患者生存时间的关系;3.通过生物信息学分析TRIM38高表达样本中免疫调节相关功能基因簇的富集情况;4.在U251和A172细胞系中分别转染两种TRIM38-si RNA后,采用细胞增殖实验测量吸光度以评估细胞活力;采用Transwell实验、细胞划痕实验评估细胞的迁移和侵袭能力;采用细胞凋亡实验评估细胞的凋亡情况;采用细胞周期实验评估细胞的周期情况;5.利用公共数据库分析TRIM38高表达的胶质母细胞瘤样本中相关通路的富集情况;采用RNA测序检测TRIM38表达对胶质母细胞瘤转录组的影响;对差异表达基因进行生物信息学分析,包括基因本体论GO（Gene Ontology,GO）富集分析和KEGG（Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析;利用Western blot验证U251和A172细胞系中相关信号通路及分子的表达情况。研究结果:1.分析RAUH、TCGA、GSE60274、GSE63347等数据库发现,与正常脑组织相比,TRIM38非CpG岛DNA甲基化位点在胶质母细胞瘤中发生显著的甲基化丢失;细胞学实验亦发现TRIM38非CpG岛DNA甲基化位点在胶质母细胞瘤瘤细胞系中发生显著低甲基化改变;Pearson关联分析显示TRIM38基因DNA甲基化与基因表达之间呈显著负相关;2.GSE16011、CGGA、REMBRANDT等数据库及免疫组化检测显示TRIM38在胶质母细胞瘤样本中表达上调,且随肿瘤级别上升而增加;3.生物信息学分析发现,TRIM38高表达的胶质母细胞瘤中促增殖、抗凋亡、NFk B信号通路和免疫调节相关功能基因簇的表达增多,以及免疫细胞浸润增多和免疫抑制因子的分泌水平增多;4.下调U251和A172细胞系中TRIM38表达后,CCK8法、Transwell、细胞划痕、细胞周期实验结果显示,下调TRIM38可明显抑制胶质母细胞瘤的增殖和迁移能力,但对细胞周期未见明显影响;细胞凋亡实验结果显示,下调TRIM38可明显促进胶质母细胞瘤的细胞凋亡;5.GO富集分析发现差异性表达的m RNA参与到I型干扰素的产生等过程;KEGG通路分析发现差异表达基因主要参与DNA免疫应答反应相关的信号通路;下调U251和A172细胞系中TRIM38表达后,c GAS-STING信号通路发生差异化调控,以TBK1-IRF3为信号轴的通路分子明显激活,而以NF-κB为信号轴的通路分子明显受到抑制。研究结论:1.TRIM38非CpG岛DNA甲基化位点在胶质母细胞瘤中发生低甲基化改变;2.与正常脑组织比,TRIM38在人脑胶质母细胞瘤组织中的表达明显增高;与正常脑星形胶质细胞比,TRIM38在人脑胶质母细胞瘤细胞系中的表达明显增高;3.下调TRIM38表达抑制胶质母细胞瘤细胞系U251和A172的增殖、侵袭和迁移等恶性表型;4.TRIM38可能通过差异化调控cGAS-STING信号通路促进胶质母细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力;5.TRIM38有希望成为临床治疗胶质母细胞瘤的潜在靶标。